生活污水中人類(lèi)腸道病毒的濃縮分離及其在環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用研究.pdf

1、背景：
　　人類(lèi)腸道病毒(Human Enteroviruses,HEVs)隸屬于微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae),以隱性感染為主,可引起如急性弛緩性麻痹(Acute FlaccidParaiysis,AFP)、無(wú)菌性腦膜炎(Aseptic Meningitis,AM)、心肌炎、急性出血性結(jié)膜炎(Acute Hemorrhagic Conjunctivitis,AHC)、手足口病(Hand,Foot and Mo

2、uthDisease,HFMD)等多種臨床疾病,還可引起新生兒全身感染,甚至死亡。
　　傳統(tǒng)上將HEVs按血清型分為脊髓灰質(zhì)類(lèi)(脊灰)病毒(Polioviruses,PV),柯薩奇病毒A類(lèi)(Coxsackievirus A,CVA),柯薩奇病毒B類(lèi)(Coxsackievirus B,CVB),?？刹《绢?lèi)(Echovirus,Echo)。2011年11月,國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)(International Committeeon Tax

3、onomy of Viruses,ICTV)發(fā)表了最新的病毒分類(lèi)第九次報(bào)告,將人鼻病毒(Human rhinovirus,HRV)歸入腸道病毒屬,HEVs重新劃分為7組,即HEV-A～HEVoD和HRV-A～HRV-C。
　　HEVs具有獨(dú)特的向外環(huán)境排毒的方式,病毒感染易感者后,受感染的個(gè)體無(wú)論有無(wú)臨床癥狀都會(huì)持續(xù)向外環(huán)境排出帶有病毒的糞便,大約持續(xù)數(shù)周。大量排到環(huán)境中的病毒顆粒,依不同的環(huán)境條件能夠存活不同的時(shí)間,并在這段時(shí)間

4、內(nèi)保持感染性。在此期間,采集生活污水標(biāo)本,即可通過(guò)不同的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)環(huán)境中的HEVs進(jìn)行濃縮、分離以及鑒定。
　　通常HEVs在污水中的含量極少,濃度極低,難以滿(mǎn)足直接檢測(cè)的需求,因此,水體中病毒的濃縮富集是病毒檢測(cè)過(guò)程中一個(gè)重要的環(huán)節(jié),是決定檢測(cè)成功或失敗的關(guān)鍵因素。目前,濃縮環(huán)境污水標(biāo)本的方法主要有吸附-洗脫法、膜過(guò)濾法和化學(xué)絮凝沉淀法等。吸附.洗脫法和膜過(guò)濾法被廣泛應(yīng)用于水體中病毒的富集檢測(cè)。本研究將兩種方法結(jié)合起來(lái),并進(jìn)行了

5、改進(jìn)和優(yōu)化,在高鎂離子濃度、低pH值條件下,采用陰離子膜吸附病毒,再加入洗脫劑,并使用超聲波振蕩,使病毒從濾膜上洗脫下來(lái)。
　　在全球消滅脊灰行動(dòng)計(jì)劃中,AFP監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可提供特定區(qū)域內(nèi)PV以及其他非脊灰腸道病毒(Non-polio Enterovirus,NPEV)分布的基線(xiàn)數(shù)據(jù),但由于AFP發(fā)病率低,且HEVs多以無(wú)癥狀感染為主,該數(shù)據(jù)尚不能完全反映HEVs的流行現(xiàn)狀;而環(huán)境監(jiān)測(cè)是檢測(cè)PV野毒株和疫苗株最敏感的方法,也是監(jiān)測(cè)HE

6、Vs循環(huán)的有效手段。因此,在我國(guó)實(shí)現(xiàn)無(wú)脊灰目標(biāo)之后,在加強(qiáng)AFP監(jiān)測(cè)工作的基礎(chǔ)上,優(yōu)化環(huán)境污水中HEVs的濃縮分離方法,并將其應(yīng)用于PV及NPEV的監(jiān)測(cè)研究,對(duì)于發(fā)現(xiàn)可能存在的PV野毒株(Wild Poliovirus,WPV)及PV疫苗衍生株(Vaccine-derived Poliovirus,VDPV),以及追蹤引起非顯性感染的NPEV傳播及其預(yù)測(cè)疾病的發(fā)生,均具有十分重要的理論和實(shí)際意義。
　　研究目的：
　　1.探

7、索優(yōu)化環(huán)境生活污水中HEVs的濃縮分離方法;
　　2.摸清采樣點(diǎn)環(huán)境生活污水中HEVs的分布,分析環(huán)境生活污水中PV和非NPEV的基因變異;
　　3.通過(guò)比較環(huán)境生活污水監(jiān)測(cè)和臨床病例中HEVs的基因進(jìn)化特征,預(yù)測(cè)HEVs相關(guān)疾病的暴發(fā)和流行,評(píng)價(jià)環(huán)境監(jiān)測(cè)在發(fā)現(xiàn)VDPV和WPV中的作用。
　　研究方法：
　　1.選擇濟(jì)南市光大生活污水處理廠(chǎng)、臨沂市首創(chuàng)水務(wù)生活污水出口處作為采樣點(diǎn),定期采集生活污水樣本,采用陰離子

8、膜.超聲波振蕩法進(jìn)行HEVs的濃縮富集;
　　2.將處理后的污水樣本,采用RD、Hep-2和L20B細(xì)胞進(jìn)行病毒分離;通過(guò)微量板中和實(shí)驗(yàn),對(duì)病毒分離陽(yáng)性的毒株進(jìn)行血清學(xué)型別鑒定;
　　3.提取核酸,進(jìn)行HEVs衣殼蛋白VP1編碼區(qū)基因擴(kuò)增和序列測(cè)定,通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行比對(duì),確定HEVs的基因型;
　　4.選取環(huán)境生活污水中HEVs主要的血清型,采用BioEdit SequenceAlignment Editor soft

9、ware7.1.3軟件,與山東省AFP病例分離株、有關(guān)臨床病例分離株以及GenBank中檢索到的其它國(guó)家和地區(qū)相同血清型分離株的VPI區(qū)核苷酸序列進(jìn)行同源性比較:
　　5.采用Mega3.1軟件,鄰接法(Neighbor-joining Method)構(gòu)建VPl區(qū)系統(tǒng)發(fā)生樹(shù),對(duì)環(huán)境生活污水中HEVs主要的基因型別進(jìn)行親緣進(jìn)化分析。
　　主要結(jié)果：
　　1.環(huán)境生活污水中HEVs的分布:2008-2010年,在山東省濟(jì)南

10、市和臨沂市共采集生活污水標(biāo)本99份,72份分離到病毒,陽(yáng)性率為72.7%。在環(huán)境生活污水中分離到的病毒包括5株2型腺病毒、58株P(guān)V疫苗相關(guān)株病毒和631株B組HEVs。其中,HEV-B包括17種血清型,分別為:Echol、Ech03、Echo6～7、Echoll～14、Echol9、Echo25、Echo29～30、CVB1～5型;其中,Echo6、Echo7、Echoll、Echol2、CVB3分離數(shù)目較多。
　　2.環(huán)境污水

11、中PV的分離情況及其變異重組分析:2008-2011年,共采集污水標(biāo)本99份,PV陽(yáng)性者28份,陽(yáng)性率為28.3%。分離到58株P(guān)V,均為疫苗相關(guān)株,未發(fā)現(xiàn)脊灰野毒株(WPV)和疫苗衍生脊灰病毒(VDPV)。濟(jì)南市環(huán)境污水中分離到39株P(guān)V,PV2是主要的血清型;臨沂市環(huán)境污水中共分離到19株P(guān)V,PV3是主要的血清型。PV全年均可分離到,無(wú)明顯季節(jié)性分布。對(duì)2010年分離到的18株P(guān)V進(jìn)行VPl區(qū)域和3D區(qū)序列測(cè)定,與Sabin疫苗株

12、病毒進(jìn)行同源性比較顯示:16株P(guān)V在VPl區(qū)發(fā)生核苷酸變異,8株在3D區(qū)發(fā)生核苷酸變異。序列分析顯示:7株(38.9%)發(fā)生基因型間重組,未發(fā)現(xiàn)與非脊灰腸道病毒(NPEV)發(fā)生重組。
　　3.環(huán)境監(jiān)測(cè)與疾病監(jiān)測(cè)中NPEV型別分布的比較:臨沂市2010年環(huán)境監(jiān)測(cè)中,共發(fā)現(xiàn)Ech06～7、Echoll、Ech013、Echol9、Ech030、CBVl～2、CVB4等9種NPEV血清型,而同時(shí)期相關(guān)病例監(jiān)測(cè)分離到的NPEV血清型為Ec

13、ho6、Echo9、Echo16、Echo30、CVB4、CVA4、CVA9、CVA1O、CVAl6、EV71等。通過(guò)比較環(huán)境監(jiān)測(cè)和AFP病例監(jiān)測(cè)系統(tǒng)中NPEV血清型,發(fā)現(xiàn)AFP監(jiān)測(cè)系統(tǒng)中分離數(shù)最多的21種血清型中,包含了環(huán)境監(jiān)測(cè)中分離到的17種血清型,二者的一致性很高。
　　4.環(huán)境監(jiān)測(cè)與疾病暴發(fā)優(yōu)勢(shì)株HEVs的遺傳進(jìn)化分析:①CVB3和CVB5是山東省AM的主要病原,毒株之間的變異進(jìn)化速度相對(duì)較慢,環(huán)境監(jiān)測(cè)分離株AM分離株親緣

14、關(guān)系較近,CVB3有明顯的地域聚集性,有多個(gè)傳播鏈流行;②Echo6和Echo11較少引起疾病發(fā)生,毒株進(jìn)化較為迅速,環(huán)境監(jiān)測(cè)分離株存在著兩個(gè)進(jìn)化分支,同一份標(biāo)本的不同分離株在系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)上位于不同進(jìn)化分支,有多條傳播鏈共同循環(huán);③Echo30也是山東省AM的主要病原之一,環(huán)境污水中分離數(shù)較少,與AM分離株親緣關(guān)系較近,都屬于F基因型。
　　結(jié)論與建議：
　　1.采用陰離子膜吸附-超聲波震蕩的濃縮分離方法,對(duì)環(huán)境生活污水中不同

15、血清型的HEVs具有較高的敏感性,特別可發(fā)現(xiàn)不引起臨床癥狀的HEVs,是追蹤HEVs非顯性感染最有效的手段。
　　2.在維持無(wú)脊灰階段,通過(guò)環(huán)境監(jiān)測(cè)未發(fā)現(xiàn)PV野毒株和疫苗衍生株病毒。采用環(huán)境監(jiān)測(cè)檢測(cè)環(huán)境污水中PV的變異和重組情況,不受采集病例標(biāo)本的限制,可作為AFP監(jiān)測(cè)系統(tǒng)之外評(píng)估人群中PV流行一種的補(bǔ)充手段。
　　3.通過(guò)同源性比較和生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)HEVs各血清型毒株VP1區(qū)核苷酸序列較原型株均發(fā)生了較大變異,環(huán)境監(jiān)測(cè)