河蚌作為水體人類腸道病毒污染指示物的研究.pdf

1、目的：利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測水環(huán)境中貝類組織中的人類腸道病毒含量，初步探索該病毒量與水體中病毒含量的關(guān)系。
　　 方法：利用PEG（聚乙二醇）沉淀法沉降貝類組織中的人類腸道病毒，沉淀物接種至Vero細(xì)胞中觀察是否出現(xiàn)CPE 反應(yīng)。沉淀病毒之前的洗脫法分為甘氨酸洗脫法（傳統(tǒng)的）和甘氨酸-蘇氨酸洗脫法（新提出的），空斑法檢測兩種洗脫-沉淀方法的回收率。同期所采的水樣（濾膜法）經(jīng)牛肉膏洗脫再經(jīng)PEG沉淀。貝類樣品及水樣均用TRIz

2、ol 法和試劑盒法提取腸道病毒RNA，根據(jù)OD260/280 值以及吸光度全面掃描的測定結(jié)果分析兩種提取方法所提RNA的質(zhì)量差別。PCR反應(yīng)中使用人類腸道病毒通用引物，提取RNA后進(jìn)行普通RT-PCR反應(yīng)。在對(duì)貝類樣品及水樣進(jìn)行絕對(duì)定量之前，需制備用來制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的熒光定量質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。本實(shí)驗(yàn)中質(zhì)粒菌為實(shí)驗(yàn)室利用T-A 克隆法自行制備（含有腸道病毒PCR產(chǎn)物目的片段）。通過菌液PCR和質(zhì)粒PCR反應(yīng)對(duì)質(zhì)粒菌進(jìn)行篩選并提取出純度符合要求的質(zhì)

3、粒，檢測DNA濃度換算出拷貝數(shù)進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。根據(jù)熔解曲線判斷四組引物濃度（a組：300 nM /300nM，b組：200 nM /200 nM，c組：100 nM /100 nM，d組：50 nM /50 nM）的引物二聚體的形成情況，選擇合適的引物濃度。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍系列稀釋，通過觀察擴(kuò)增曲線等選擇合適的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋度范圍制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，檢測貝類組織樣品及水樣中的腸道病毒含量。
　　 結(jié)

4、果：貝類組織的沉淀物接種至Vero細(xì)胞，出現(xiàn)明顯的CPE 反應(yīng)。兩種洗脫方法，甘氨酸洗脫法（全貝）的回收率為19.6％，甘氨酸-蘇氨酸洗脫法（貝類腸道）的回收率為13.1％，選擇甘氨酸洗脫法進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。TRIzol 法和試劑盒法提取RNA的OD值260/280 比較結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t 值=8.53，P 值<0.05），全面掃描顯示TRIzol法中殘留的小分子鹽類物質(zhì)（OD=230 nm）較多，而試劑盒法的波峰集中于核酸吸收峰處（

5、OD=260 nm），試劑盒法提取RNA 純度較好。貝類組織及水樣經(jīng)過普通PCR反應(yīng)，凝膠電泳均顯示明顯的目的條帶片段，用PEG 法提取腸道病毒較成功。菌液PCR和質(zhì)粒PCR反應(yīng)均顯示明顯的目的條帶，OD 值260/280 均大于1.8，提取的質(zhì)粒DNA較純。優(yōu)化后的引物濃度為100 nM /100 nM，選擇稀釋度范圍為103~107的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，貝類樣品中檢測出的腸道病毒拷貝量最高為1.12×103