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1、鄰苯二甲酸丁基芐酯(Butylbenzylphthalate,BBP)是鄰苯二甲酸酯類化合物PAEs的一種,具有很強(qiáng)的軟化和溶劑化能力,可作增塑劑用;因此,在全球范圍內(nèi)得到大量的生產(chǎn)和廣泛的運(yùn)用。與此同時(shí),作為七十種環(huán)境激素之一,它也已成為全球性的有機(jī)污染物,引起了國(guó)內(nèi)外專家學(xué)著的高度重視和廣泛關(guān)注。已有研究發(fā)現(xiàn)它具有生殖毒性、發(fā)育毒性、氧化損傷作用及內(nèi)分泌干擾作用。但其對(duì)人和動(dòng)物的神經(jīng)毒性的研究目前尚少,而且其作用機(jī)制也尚不清楚。本研
2、究采用小鼠行為學(xué)的方法、細(xì)胞活力測(cè)定、酶活測(cè)定、顯微熒光技術(shù),以整體動(dòng)物毒理實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)相結(jié)合,綜合評(píng)價(jià)BBP的神經(jīng)毒性;通過(guò)對(duì)ROS水平和氧化損傷作用檢測(cè)以及致凋亡作用的研究,初步探討B(tài)BP對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷的作用機(jī)理。
采用濃度為0(空白對(duì)照組),50,250和1,250mg/kg的BBP對(duì)昆明小鼠進(jìn)行灌胃染毒(14d),同時(shí)進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)以及強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn),檢測(cè)BBP對(duì)小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的影響;
3、在染毒結(jié)束后取腦、肝、腎組織進(jìn)行氧化損傷水平的測(cè)定。此外,取各組腦組織大腦海馬區(qū)做組織切片進(jìn)行顯微觀察。
結(jié)果顯示,在水迷宮實(shí)驗(yàn)中0mg/kg和50mg/kgBBP染毒組小鼠均在平臺(tái)所在象限的游泳時(shí)間較長(zhǎng),在非平臺(tái)所在象限游泳時(shí)間相比平臺(tái)象限短了很多。0mg/kg染毒組小鼠在平臺(tái)象限(SE象限)的游泳時(shí)間與其他象限的游泳時(shí)間有顯著性的差異。而1,250mg/kg染毒組小鼠在SE象限游泳的時(shí)間較短,相對(duì)與0mg/kg染毒組小
4、鼠在SE象限的游泳時(shí)間有顯著性的差異(P<0.05)。而在懸尾實(shí)驗(yàn)中,50和1,250mg/kg染毒組小鼠相對(duì)于空白對(duì)照組的懸尾不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)(P<0.05),在1,250mg/kg的高劑量濃度時(shí)小鼠的懸尾不動(dòng)時(shí)間相對(duì)于空白對(duì)照組出現(xiàn)極顯著差異,(P<0.01)。與懸尾實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同的是;強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中,在設(shè)定的濃度范圍能未出現(xiàn)極顯著性的差異;僅在1,250mg/kg染毒組時(shí)小鼠的不動(dòng)時(shí)間對(duì)比與空白對(duì)照組才出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)。<
5、br> 在氧化損傷水平檢測(cè)中,ROS產(chǎn)生水平在腦、肝、腎各組織中各不相同;250mg/kg染毒組小鼠肝腎中ROS水平與對(duì)照組相比顯著性升高(P<0.05),而在1,250mg/kg染毒組小鼠相較于對(duì)照組,腦中ROS水平出現(xiàn)顯著性升高(P<0.05),肝和腎中ROS水平有極顯著性的升高(P<0.01)。1,250mg/kgBBP染毒組小鼠腦肝腎各組織中MDA的含量與對(duì)照組相比有顯著性升高(P<0.01)。在GSH含量的測(cè)定中,腦組織
6、在250mg/kgBBP染毒組與對(duì)照組相比,具有顯著性差異(P<0.05),而肝和腎在1,250mg/kgBBP染毒組相比對(duì)照組,才出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)。
大腦海馬區(qū)組織切片表明,隨著BBP染毒濃度的增加,小鼠大腦海馬區(qū)細(xì)胞不完整性增強(qiáng),1,250mg/kgBBP染毒組小鼠大腦海馬區(qū)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。控制小鼠空間學(xué)習(xí)記憶的背側(cè)1/3的海馬細(xì)胞受到損傷,因此推測(cè)高濃度BBP導(dǎo)致CA1區(qū)遲發(fā)性神經(jīng)元死亡引起空間學(xué)習(xí)記
7、憶障礙。
采用濃度為10g/L、5g/L、2.5g/L、1.25mg/L、0.625g/L、0.3125g/L、0.156g/L、0.078g/LBBP染毒小鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞(N2a)。通過(guò)MTT來(lái)檢測(cè)BBP對(duì)細(xì)胞的毒性;同時(shí),測(cè)定細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生水平以及顯微觀察ROS產(chǎn)生的程度;進(jìn)而測(cè)定細(xì)胞中MDA和GSH含量,反映BBP對(duì)細(xì)胞的氧化損傷程度。通過(guò)hoechst33258染色觀察細(xì)胞的凋亡程度。
結(jié)果顯示,在
8、10g/LBBP染毒24h后ROS水平相對(duì)與對(duì)照組出現(xiàn)顯著性;染色后熒光顯微觀察,隨著染毒濃度的升高,熒光強(qiáng)度也越來(lái)越大。MTT測(cè)定實(shí)驗(yàn)顯示,在10g/L、5g/L對(duì)比空白對(duì)照組均出現(xiàn)了顯著性的差異,其他濃度組MTT有一定的升高,表現(xiàn)出了低濃度BBP對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用。Hoechst33258染色結(jié)果顯示,隨著染毒濃度增加細(xì)胞核不規(guī)則程度增加,出現(xiàn)凋亡小體等;并且在常規(guī)鏡下觀察時(shí),細(xì)胞界限不清。本研究表明高濃度的BBP具有神經(jīng)細(xì)
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