鄰苯二甲酸二丁酯雄性生殖毒性及其機(jī)制研究.pdf

1、鄰苯二甲酸酯(phthalate acid esters,PAEs)是一類結(jié)構(gòu)相似且廣泛使用的化學(xué)物質(zhì),主要作用是軟化塑料和增強(qiáng)塑料的彈性.鄰苯二甲酸二丁酯(phthalic acid dibutyl ester,or dibutyl phthalate,DBP,)是PAEs中的主要成員之一,與其它PAEs不同,DBP已不再是主要的增塑劑,而主要作為乳膠膠粘劑的成份,同時(shí)還用于室內(nèi)裝璜材料、染料溶劑、化妝品及其它個(gè)人防護(hù)用品等.人類在工

2、作和生活中有多種途徑可以接觸到DBP,如DBP的生產(chǎn)、以DBP為原料的產(chǎn)品制造、含有DBP材料的使用,以及環(huán)境中(包括水、食物和空氣等)大量存在的DBP.DBP主要以其代謝產(chǎn)物的形式吸收進(jìn)入體內(nèi),不在體內(nèi)蓄積,一般情況下以與葡萄糖醛酸結(jié)合的形式在48h內(nèi)經(jīng)尿排出體外.PAEs已被確認(rèn)為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(environmental endocrine disruptors,EEDs)之一,雖然還沒(méi)有直接的證據(jù)表明DBP對(duì)人類生殖和發(fā)育的損

3、害作用,但動(dòng)物(主要是嚙齒類動(dòng)物)實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)證明DBP能干擾正常的生殖系統(tǒng)功能.DBP對(duì)雄性動(dòng)物生殖和發(fā)育的影響包括精子生成障礙、睪酮合成量下降以及胚胎畸形等,但其機(jī)制還不清楚.該研究從精子生成量及精子動(dòng)力、睪丸標(biāo)志酶、脂質(zhì)過(guò)氧化、睪酮合成相關(guān)酶mRNA表達(dá)、睪丸細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)等方面探討DBP對(duì)雄性生殖的影響,為接觸人群早期生物學(xué)監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)提供參考指標(biāo).第一部分鄰苯二甲酸二丁酯對(duì)生精過(guò)程及精子活率的影響將6周齡雄性SD大鼠隨機(jī)分成0、2

4、50、500、1000mg·kg<'-1>·.d<'-1>4組,每組16只,灌胃給予DBP.分別于染毒2周和4周后,頸椎脫臼法各處死8只動(dòng)物.觀察動(dòng)物一般情況、體重以及臟器系數(shù)的變化,.股動(dòng)脈取血,迅速分離臟器,液氮速凍后-80℃保存?zhèn)溆?常規(guī)分離血清,-20℃保存?zhèn)溆?用計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)(CASA)觀察附睪尾精子運(yùn)動(dòng)速度參數(shù)和精子運(yùn)動(dòng)方式參數(shù)的變化.用分光光度法測(cè)定血清和睪丸勻漿中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(G

5、SHPx)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(ALP)、乳酸脫氫酶(LDH)、山梨醇脫氫酶(SDH)和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PD)活力以及丙二醛(MDA)和還原型谷胱甘肽(GSH)含量.結(jié)果顯示,染毒2周和4周后,隨著染毒劑量的增加體重增加量呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì),1000 mg·kg<'-1>·d<'-1>劑量組與對(duì)照組相比均有顯著性差異(p<0.01).睪丸臟器系數(shù)顯著下降,1000mg·kg<'-1>·d<'-1>劑量組與對(duì)

6、照組相比均有顯著性差異(p<0.01).精子頭計(jì)數(shù)(SPC)和每日精子生成量(SPR)呈現(xiàn)出單一的下降趨勢(shì),500 mg·kg<'-1>·d<'-1>和1000 mg·kg<'-1>·d<'-1>劑量組與對(duì)照組相比差異均有顯著性(p<0.01).染毒2周后,血清中GSHPx活性和睪丸勻漿中GSH水平下降趨勢(shì)明顯,而勻漿中GSHPx活性呈上升趨勢(shì),1000 mg·kg<'-1>·d<'-1>組與對(duì)照組相比有顯著性差異(p<0.05).染毒

7、4周后,血清中ALP活性呈現(xiàn)上升的趨勢(shì).血清和睪丸勻漿中SDH活性受到明顯抑制,1000 mg·kg<'-1>·d<'-1>組與對(duì)照組相比均有顯著性差異(p<0.01).睪丸勻漿SOD活力降低,高劑量組與對(duì)照組相比差異有顯著性(p<0.05).血清GSH水平表現(xiàn)出上升趨勢(shì),1000 mg·kg<'-1>·d<'-1>組與對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.05).精子曲線運(yùn)動(dòng)速度(VCL)隨染毒劑量的增加呈下降趨勢(shì),高劑量組與對(duì)照組相比差異

8、均有顯著性(p<0.05).以上結(jié)果提示,睪丸是DBP毒作用的主要靶器官之一;DBP可引起大鼠睪丸精子生成量和抗氧化能力的下降.第二部分鄰苯二甲酸二丁酯對(duì)支持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的影響將6周齡雄性SD大鼠隨機(jī)分成0、250、500、1000 mg·kg<'-1>·d<'-1>4組,每組16只,灌胃給予DBP.分別于染毒2周和4周后,頸椎脫臼法各處死8只動(dòng)物.觀察動(dòng)物一般情況及體重的變化.股動(dòng)脈取血,迅速分離臟器,液氮速凍后-80℃保存?zhèn)溆?常

9、規(guī)分離血清,-20℃保存?zhèn)溆?放射免疫法測(cè)定血清卵泡刺激素(FSH)濃度.Trizol法提取睪丸細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測(cè)定雄激素結(jié)合蛋白(ABP)和抑制素(INH)mRNA的相對(duì)表達(dá)量.透射電子顯微鏡觀察支持細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu).結(jié)果顯示,染毒4周后,FSH表現(xiàn)出明顯的上升趨勢(shì),250mg·kg<'-1>·d<'-1>與1000 mg·kg<'-1>·d<'-1>劑量組和對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05).ABP

10、 mRNA和INH mRNA表達(dá)水平隨著染毒劑量的增加呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢(shì),染毒2周后,500 mg·kg<'-1>·d<'-1>與1000mg·kg<'-1>·d<'-1>劑量組和對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.01);染毒4周后,ABP mRNA和INH mRNA表達(dá)水平隨著染毒劑量的增加進(jìn)一步下降,各劑量組與染毒2周相比都有降低,500 mg·kg<'-1>·d<'-1>與1000 mg·kg<'-1>·d<'-1>劑量組和對(duì)照組

11、相比有顯著性差異(P<0.01).電鏡觀察顯示,高劑量組支持細(xì)胞與生精細(xì)胞比例失調(diào),胞漿中初級(jí)溶酶體增多,核高度畸形,線粒體輕度退行性變化,部分異染色質(zhì)有邊集現(xiàn)象,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生、高度擴(kuò)張.根據(jù)以上結(jié)果,我們可以認(rèn)為:支持細(xì)胞是DBP的主要靶細(xì)胞之一;DBP通過(guò)誘導(dǎo)ABP mRNA和INH mRNA表達(dá)水平下調(diào),繼而使ABP和INH合成量減少,干擾精子發(fā)生的過(guò)程.同時(shí),破壞了下丘腦-垂體-睪丸軸的生理平衡.第三部分鄰苯二甲酸二丁酯對(duì)間質(zhì)細(xì)胞

12、結(jié)構(gòu)和功能的影響將6周齡雄性SD大鼠隨機(jī)分成0、250、500、1000 mg·kg<'-1>·d<'-1>4組,每組16只,灌胃給予DBP.分別于染毒2周和4周后,頸椎脫臼法各處死8只動(dòng)物.觀察動(dòng)物一般情況及體重的變化.股動(dòng)脈取血,迅速分離臟器,液氮速凍后-80℃保存?zhèn)溆?常規(guī)分離血清,-20℃保存?zhèn)溆?放射免疫法測(cè)定血清LH、E<,2>、T和睪丸勻漿T.睪丸勻漿上清液蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮蘭法.Trizol法提取睪丸細(xì)胞總RNA,

13、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)定細(xì)胞色素P450膽固醇側(cè)鏈裂解酶(P450Scc)、3β類固醇脫氫酶(3βHSD)mRNA的相對(duì)表達(dá)量.透射電子顯微鏡觀察間質(zhì)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu).結(jié)果顯示,DBP染毒后,未見(jiàn)有血清LH水平發(fā)生顯著性的變化,但血清17βE<,2>濃度在染毒4周后250 mg·kg<'-1>·d<'-1>和1000mg·kg<'-1>·d<'-1>劑量組與對(duì)照組比較有顯著性差異(p<0.01).血清T水平無(wú)論是染毒2周還是4周均有明顯的降

14、低,500mg·kg<'-1>·d<'-1>和1000mg·kg<'-1>·d<'-1>劑量組與對(duì)照組比較均有顯著性差異(p<0.01).勻漿T濃度在染毒2周后,僅高劑量組與對(duì)照組比較有顯著性差異((p<0.01)),而在染毒4周后,500mg·kg<'-1>·d<'-1>和1000mg·kg<'-1>·d<'-1>劑量組與對(duì)照組比較均有顯著性差異(p<0.01).P450SccmRNA和3β-HSD表達(dá)水平隨著染毒劑量的增加下降趨勢(shì)明

15、顯.相關(guān)與回歸分析結(jié)果顯示,P450SccmRNA和3βHSD mRNA(Y)表達(dá)水平與染毒劑量(對(duì)數(shù),X)之間存在明顯的-劑量反應(yīng)關(guān)系.染毒2周后,r=0.821,回歸方程為:Y=0.931-0.1 92X(p<0.01).染毒4周后,r=0.783,回歸方程為:Y=0.536-0.1X(p<0.01).3βHSD mRNA在染毒2周后,r=0.748,回歸方程為:Y=0.979-0.120X(p<0.01).染毒4周后,r=0.79

16、4,回歸方程為:Y=0.787-0.133X(p<0.01).電鏡觀察顯示,DBP導(dǎo)致了間質(zhì)細(xì)胞(LC)超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的改變,胞漿有空泡出現(xiàn),平滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生、增多.線粒體基質(zhì)電子密度增加,線粒體嵴模糊不清,核退變、異染色質(zhì)出現(xiàn)邊集現(xiàn)象.上述結(jié)果提示,LC也是DBP的靶細(xì)胞之一;DBP導(dǎo)致T合成減少的可能機(jī)制有:第一,DBP使T合成相關(guān)酶mRNA表達(dá)水平下調(diào),引起這些酶合成減少、活性降低.第二,17βE<,2>水平的上升干擾了下丘腦-