二甲磺酸乙烷模型中鄰苯二甲酸酯對睪丸間質(zhì)細(xì)胞的影響.pdf

1、睪丸間質(zhì)細(xì)胞作為雄性體內(nèi)最主要的雄激素來源，其發(fā)育過程及功能受到了各種環(huán)境因素的影響。其中已證實(shí)塑化劑鄰苯二甲酸酯可以顯著抑制雄性體內(nèi)睪酮水平，并進(jìn)一步影響雄性生殖系統(tǒng)的發(fā)育與功能，但其中機(jī)制尚未完全清楚。并且大鼠青春期睪丸間質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育過程可以通過二甲磺酸乙烷(EDS)模型來模擬。因此本研究以EDS模型為中心，探討EDS處理后再生的睪丸間質(zhì)細(xì)胞譜系中各細(xì)胞類型的比較以及EDS模型中鄰苯二甲酸酯對睪丸間質(zhì)細(xì)胞數(shù)目及功能的影響及其機(jī)制。實(shí)

2、驗(yàn)分為三個部分:
　　(1)大鼠二甲磺酸乙烷處理后再生的睪丸間質(zhì)細(xì)胞譜系中各細(xì)胞類型的比較
　　本部分實(shí)驗(yàn)的目的是純化EDS處理后再生的睪丸間質(zhì)細(xì)胞，并比較它們的類固醇合成能力。從EDS處理后21、28和56天的睪丸中分別分離再生的睪丸間質(zhì)祖細(xì)胞(RPLCs)、未成熟睪丸間質(zhì)細(xì)胞（RILCs）和成年睪丸間質(zhì)細(xì)胞(RALCs)。在RPLCs、RILCs和RALCs的培養(yǎng)基中加入100 ng/ml促黃體生成素體外培養(yǎng)3h后測定雄

3、激素包括雄酮、5α-雄烷-17β，3α-二醇(DIOL)、睪酮和雄烯二酮的生成率。檢測這些細(xì)胞中類固醇合成酶的活性及其mRNA水平。發(fā)現(xiàn)從正常90天齡大鼠的睪丸中分離的成年睪丸間質(zhì)細(xì)胞(ALCs)主要產(chǎn)生睪酮(69.73％)，與其相比，RPLCs和RILCs分別主要產(chǎn)生雄酮(70.21％)和DIOL(69.79％)。EDS處理后56天大鼠睪丸中分離的睪丸間質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出與ALC相似的類固醇合成能力，主要產(chǎn)生睪酮(72.90％)。RPLCs

4、具有膽固醇側(cè)鏈裂解酶（由Cyp11a1編碼）活性、3β-羥基類固醇脫氫酶1（Hsd3b1編碼）和17α-羥化酶(Cyp17a1編碼)，但17β-羥基類固醇脫氫酶3(Hsd17b3編碼)和11β-羥基類固醇脫氫酶1(Hsd11b1編碼)的活性幾乎檢測不到。而RILCs增加了17β-羥基類固醇脫氫酶3和11α-羥基類固醇脫氫酶1的活性。由于RPLCs和RILCs具有較高的5α-還原酶1和3α-羥基類固醇脫氫酶的活性，因此他們主要產(chǎn)生5α-還

5、原性的雄激素。Real-time PCR也證實(shí)了這些類固醇合成酶的mRNA表達(dá)具有相似的趨勢?？傊兓腞PLCs、RILCs和RALCs與大鼠的青春期發(fā)育過程具有相似性。
　　(2)鄰苯二甲酸酯促進(jìn)成年大鼠干細(xì)胞向睪丸間質(zhì)細(xì)胞譜系的分化
　　本部分實(shí)驗(yàn)的目的是研究鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）增加睪丸間質(zhì)細(xì)胞數(shù)目的作用機(jī)制。90天齡Long-Evans大鼠隨機(jī)分為3組，分別采用玉米油、10或750 mg/kg

6、/day DEHP灌胃7天，并在7天末腹腔注射75 mg/kgEDS以消除睪丸間質(zhì)細(xì)胞。EDS處理后4天對照組睪丸中的睪丸間質(zhì)細(xì)胞完全消除，可以通過檢測不到的血清睪酮水平以及睪丸間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物如3β-羥基類固醇脫氫酶(3β-HSD)、Lhcgr、Cyp11a1、Cyp17a1、Insl3和Hsd11b1的mRNA表達(dá)進(jìn)行判斷。然而，我們檢測了大鼠DEHP處理組的睪酮水平以及3βHSD陽性細(xì)胞、Lhcgr、Cyp11a1和Cyp17a1的

7、表達(dá)水平。這些3βHSD陽性細(xì)胞不具有成年睪丸間質(zhì)細(xì)胞的生物標(biāo)志物如11β-羥基類固醇脫氫酶1染色以及Insl3、Hsd17b3和Hsd11b1的表達(dá)，這表明3βHSD陽性細(xì)胞是在睪丸間質(zhì)祖細(xì)胞階段新形成的。目前的研究表明，DEHP促進(jìn)睪丸間質(zhì)干細(xì)胞向睪丸間質(zhì)祖細(xì)胞的分化。
　　(3)鄰苯二甲酸酯對成年大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞再生的抑制作用
　　本部分實(shí)驗(yàn)的目的是確定成年大鼠DEHP暴露是否影響睪丸間質(zhì)細(xì)胞的再生。90天齡Long-

8、Evans大鼠腹腔注射75 mg/kg EDS，以消除成年睪丸間質(zhì)細(xì)胞，然后隨機(jī)分為3組，分別采用玉米油（對照）、10或750 mg/kg/day DEHP灌胃35天。通過RIA法檢測血清睪酮和LH，評價睪丸間質(zhì)細(xì)胞數(shù)目與增殖率，通過qPCR法測定睪丸間質(zhì)細(xì)胞特定基因的mRNA水平。EDS處理后14、21和35天，10和750 mg/kg DEHP處理組的睪丸間質(zhì)細(xì)胞數(shù)目增加，由于EDS處理后14至21天顯著增加了睪丸間質(zhì)前體細(xì)胞的數(shù)目