鄰苯二甲酸酯對秀麗隱桿線蟲的雌性生殖毒性.pdf

1、目的：
　　鄰苯二甲酸酯(PAEs)作為聚氯乙烯塑料的增塑劑，在塑料生產和生活使用過程中釋放進入環(huán)境，在多種環(huán)境介質中均能檢出，作為一類環(huán)境內分泌干擾物，其對水生生物和藻類的繁殖和生長發(fā)育都造成了不同程度的影響。本研究利用秀麗隱桿線蟲研究PAEs的雌性生殖毒性，尋找評價PAEs生殖毒性的敏感指標，探討PAEs對卵子發(fā)生過程的損傷作用，探討其發(fā)揮生殖毒性作用的機制。
　　方法和結果：
　　一.PAEs對秀麗隱桿線蟲的生殖

2、毒性作用
　　1.PAEs對秀麗隱桿線蟲繁殖力的影響
　　測定PAEs對線蟲的急性毒性，每個試驗暴露組選擇同步化L4期后24h的N2線蟲，設五個染毒劑量組(100、10、1、0.1、0.01mg/L)、溶劑對照組和空白對照組，24孔板染毒暴露24h，染毒結束后觀測各個組線蟲死亡數，計算PAEs對線蟲的LC50。試驗結果顯示PAEs的LC50遠高于100 mg/L，各個劑量組線蟲死亡數與溶劑對照組比較均無統(tǒng)計學差異;應用后代數

3、目和世代時間評價PAEs對線蟲生育力的影響，每個試驗暴露組選擇同步化L4期后24h的N2線蟲，設三個染毒劑量(10、1、0.1mg/L)、溶劑對照組和空白對照組，24孔板染毒暴露24h，染毒結束后計數線蟲后代數目和測定線蟲世代時間。結果顯示僅DEHP的高劑量染毒組的后代數目與溶劑對照組比較有統(tǒng)計學差異的減少，其他染毒物的各個劑量組均未出現(xiàn)明顯變化;PAEs的各個染毒劑量暴露后，世代時間均未出現(xiàn)有統(tǒng)計學差異的延長或縮短。
　　2.P

4、AEs對秀麗隱桿線蟲卵子發(fā)生的影響
　　應用生殖細胞數目評價PAEs對線蟲卵子發(fā)生的影響，每個試驗暴露組選擇同步化L4期后24h的N2線蟲，染毒劑量和暴露方式同上，染毒結束后DAPI染色。結果顯示，DEHP、DBP和DIBP的中高劑量組的生殖細胞數與溶劑對照組比較均出現(xiàn)了有統(tǒng)計學差異的減少，各個染毒物低劑量組均未出現(xiàn)有統(tǒng)計學差異的改變;JK2868突變株(Plag-2∷GFP)的性腺DTC細胞熒光強度反映性腺結構是否正常，每個試驗

5、暴露組為同步化L4期后24h的JK2868突變株線蟲，染毒劑量和暴露方式同上，染毒結束后檢測DTC細胞熒光強度，熒光分析結果提示PAEs染毒暴露后DTC熒光強度未發(fā)生改變，提示PAEs不通過影響性腺結構來發(fā)揮生殖毒作用。
　　二.PAEs影響秀麗隱桿線蟲卵子發(fā)生的作用機制
　　1.PAEs對秀麗隱桿線蟲生殖細胞凋亡影響
　　計數凋亡的生殖細胞數反映PAEs對線蟲凋亡的影響，每個試驗暴露組MD701突變株(Plim-7∷

6、ced-1∷gfp)線蟲的染毒劑量和暴露方式同上，染毒結束后，熒光顯微鏡下檢測線蟲生殖細胞的凋亡數，試驗結果顯示PAEs使線蟲凋亡水平上升，各個毒物的中高劑量組凋亡細胞數與溶劑對照組比較均有統(tǒng)計學差異;WS1433突變株(HUS-1∷GFP)指示線蟲生殖細胞DNA損傷誘導的凋亡，每個試驗暴露組選擇同步化L4期后24h的WS1433突變株線蟲，染毒劑量和暴露方式同上，染毒結束后，在熒光顯微鏡下顯示PAEs高劑量染毒組中，線蟲生殖細胞DNA

7、修復指示熒光明顯增強，提示PAEs暴露后線蟲生殖細胞出現(xiàn)DNA損傷誘導的凋亡。
　　2.PAEs對秀麗隱桿線蟲生殖細胞凋亡作用機制研究
　　檢測凋亡相關基因的表達水平，反映其在凋亡通路中的作用，每個試驗暴露組選擇80-100μL同步化L4期后24h的N2線蟲，染毒劑量和暴露方式同上，染毒結束后提取線蟲總RNA，RT-qPCR檢測線蟲組織中凋亡發(fā)生相關基因egl-1、cep-1、ced-9、ced-4和ced-3基因的表達水平

8、，結果顯示egl-1、cep-1、ced-4和ced-3基因表達水平明顯升高，ced-9基因表達水平顯著下降;應用凋亡基因突變株驗證凋亡基因在通路中的作用，凋亡相關基因egl-1、cep-1、ced-9、ced-4和ced-3敲除突變株染毒劑量和暴露方式同上，染毒結束后測定PAEs染毒暴露后生殖細胞凋亡數目，試驗結果顯示egl-1、cep-1、ced-4和ced-3突變株染毒后凋亡數目明顯下降，ced-9突變株染毒后凋亡數目明顯增加。<

9、br>　　三.PAEs對秀麗隱桿線蟲氧化應激的影響
　　1.PAEs對秀麗隱桿線蟲氧化應激的影響
　　測定線蟲體內ROS反映線蟲氧化應激水平，CM-H2DCFDA探針指示線蟲體內產生的ROS，每個試驗暴露組選擇同步化L4期后24h的N2線蟲，染毒劑量和暴露方式同上，染毒結束后，用CM-H2DCFDA探針測定線蟲體內ROS水平，熒光顯微鏡下探針結果顯示，PAEs的中高劑量組線蟲體內ROS水平均上升;測定ROS中主要成分H2O2

10、水平，每個試驗暴露組選擇80-100μL同步化L4期后24h的N2線蟲，染毒劑量和暴露方式同上，染毒結束后研磨線蟲，測定線蟲體內H2O2水平，試驗結果顯示各個劑量組H2O2水平無差異性改變。
　　2.PAEs對秀麗隱桿線蟲氧化應激機制研究
　　檢測氧化應激相關基因的表達水平，反映其在氧化應激通路中的作用，每個試驗暴露組選擇80-100μL同步化L4期后24h的N2線蟲，染毒劑量和暴露方式同上，染毒結束后提取線蟲總RNA，RT

11、-qPCR檢測線蟲組織中凋亡發(fā)生相關基因mev-1、gas-1、isp-1、clk-2基因的表達水平，結果顯示isp-1、clk-2基因表達水平明顯升高，mev-1、gas-1基因表達水平顯著下降。
　　3.PAEs對秀麗隱桿線蟲生殖細胞DNA損傷研究
　　應用線蟲DNA AP位點數反映DNA損傷情況，每個試驗暴露組選擇80-100μL同步化L4期后24h的N2線蟲，染毒劑量和暴露方式同上，染毒結束后提取線蟲DNA，測定線蟲

12、DNAAP位點數，結果顯示PAEs的不同染毒暴露組的AP位點數隨染毒劑量增加而增加，DEHP的中高劑量組以及DBP、DIBP各個劑量組與溶劑對照組比較均有統(tǒng)計學差異。
　　結論：
　　PAEs屬于低毒性物質，后代數目和世代時間不是評價PAEs對秀麗隱桿線蟲生殖毒性的敏感指標，染毒暴露后卵子數目的改變相對后代數目和世代時間更敏感。PAEs通過誘導線蟲體內ROS水平增加、產生AP位點數增加的DNA損傷，出現(xiàn)DNA損傷誘導的生殖細