眼肌型和全身型重癥肌無力患者胸腺不同分子的表達研究.pdf

1、重癥肌無力（MyastheniaGravis,MG）是一種發(fā)生在神經(jīng)肌肉接頭（Neuromuscularjunction，NMJ）傳遞障礙的獲得性自身免疫性疾病，病變主要累及神經(jīng)-肌肉接頭突觸后膜上的乙酰膽堿受體（Acetylcholinereceptor，AChR）；該病是嚴重危害患者身心健康的常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一。因該病具有明確的抗原—AChR、抗體—乙酰膽堿受體抗體（nicotinicacetylcholinereceptora

2、ntibody，AChRAb）及病理作用靶點—NMJ，是研究自身免疫性疾病發(fā)病機制和防治的理想模型之一。MG患者的主要臨床癥狀為橫紋肌收縮無力，最常見癥狀為眼外肌收縮無力，嚴重者累及全身肌肉，部分患者累及呼吸肌，出現(xiàn)呼吸肌麻痹，發(fā)生肌無力危象而死亡。臨床根據(jù)受累部位及表現(xiàn)不同，將MG分為眼肌型MG（Ocularmyastheniagravis，OMG）（Ⅰ型，僅累及眼外肌，表現(xiàn)為眼外肌麻痹、無力為主，可出現(xiàn)波動性的眼瞼下垂、復視等）和全

3、身型MG（Generalizedmyastheniagravis，GMG）（Ⅱ型～Ⅴ型，累及四肢骨骼肌和/或咽喉肌，表現(xiàn)為全身骨骼肌麻痹、無力為主，出現(xiàn)四肢及軀干肌肉麻痹、無力，甚至出現(xiàn)呼吸肌麻痹、無力，發(fā)生肌無力危象、死亡等）。半個多世紀以來，MG發(fā)病機制的研究一直是神經(jīng)病學和免疫學領域共同關注的熱點之一。
　　MG患者胸腺長期處于一直慢性炎癥狀態(tài)，80～90％的MG患者存在胸腺組織的異常，主要表現(xiàn)為胸腺增生、囊腫、壞死、肥大，

4、或者合并胸腺瘤等。切除病變胸腺，或者對于難治性MG患者來說，切除貌似正常實則可能慢性炎癥的胸腺，均可使MG患者臨床癥狀得到有效緩解，而且在手術切除胸腺后患者的細胞免疫、體液免疫均受抑制，AChRAb減少，表明胸腺在誘導和維持MG的發(fā)生、發(fā)展過程中起非常重要的作用。因此，有推測誘發(fā)MG患者免疫異常的始動部位是胸腺，但是MG患者的胸腺內(nèi)究竟發(fā)生了什么樣的異常免疫反應仍然不清楚，深入研究MG患者胸腺內(nèi)發(fā)生的異常免疫反應與OMG和GMG患者不同

5、臨床癥狀之間的聯(lián)系，對闡明MG的發(fā)病機制及治療具有重要意義，對其他自身免疫性疾病的防治也有重要的指導意義。本研究擬采用免疫組織化學（Immunohistochemical，IHC）技術、免疫熒光（Immunofluorescence，IF）技術、實時定量聚合酶鏈反應（Real-Timepolymerasechainreaction，R-TPCR）、單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）及免疫印

6、跡（Western-blot，WB）等方法分析OMG和GMG患者胸腺不同的分子表達，以期闡述胸腺內(nèi)發(fā)生的異常免疫反應與OMG和GMG患者不同臨床癥狀之間的聯(lián)系。
　　第一部分OMG、GMG患者合并胸腺瘤時胸腺的不同分子表達
　　目的：
　　1.分析OMG和GMG合并胸腺瘤患者發(fā)病年齡、性別及病程之間的差異。
　　2.分析Foxp3和CXCL13在OMG和GMG合并不同組織學類型胸腺瘤時的不同表達。
　　方法

7、：
　　取2003～2010年唐都醫(yī)院MG合并胸腺瘤患者病理標本（胸腺）為研究對象，共計胸腺瘤患者311例。合并MG患者116例，符合納入標準、最終納入患者58例，其中OMG合并胸腺瘤患者35例，GMG合并胸腺瘤患者23例，胸腺瘤無MG（NonewithMG，Non-MG）患者73例為對照組。
　　使用SPSS13.0分析MG患者合并胸腺瘤一般資料，采用IHC分析Foxp3和CXCL13在不同胸腺瘤組織學類型MG患者胸腺的表

8、達。
　　結果：
　　與GMG合并胸腺瘤患者對比，OMG合并胸腺瘤男性患者多為晚發(fā)型，發(fā)病年齡較GMG合并胸腺瘤晚（P=0.037），而女性GMG、OMG患者合并胸腺瘤起病在起病年齡上的差異并不明顯（P=0.126）。與OMG患者胸腺分子表達相比，F(xiàn)oxp3的表達在GMG組AB型、B1型、B2型胸腺瘤患者中較低，其中AB型、B1型差異顯著，有統(tǒng)計學意義（P=0.001,0.043）。與OMG患者胸腺分子表達相比，CXCL13

9、在GMG合并B1、B2型胸腺瘤患者的胸腺中表達均較高，有統(tǒng)計學意義（P=0.027,0.048）。而且，與Non-MG患者的胸腺分子表達相比，GMG合并胸腺瘤AB型患者胸腺中，CXCL13的表達高，且有統(tǒng)計學意義（P=0.003）。
　　結論：
　　GMG和OMG患者合并胸腺瘤時，在起病年齡、性別上存在明顯的差異。同時，OMG和GMG患者合并不同組織學類型的胸腺瘤，其分子表達也存在明顯差異，提示胸腺瘤組織學類型與分子的表達可

10、能均參與影響了MG的不同臨床類型。
　　第二部分OMG、GMG患者合并胸腺增生時胸腺的不同分子表達
　　目的：
　　1.IHC、R-TPCR分析CD4、CD25、Foxp3和CXCL13在嬰兒胸腺、成人萎縮胸腺、胸腺增生Non-MG患者胸腺的不同表達。
　　2.IHC、R-TPCR分析CD4、CD25、Foxp3和CXCL13在OMG、GMG、Non-MG合并胸腺增生時患者胸腺的不同表達。
　　3.分析CD

11、4、CD25、Foxp3和CXCL13表達的不同與OMG、GMG患者病情的相關性。
　　方法：
　　取2008～2011年唐都醫(yī)院MG合并胸腺增生患者病理標本為研究對象，共計MG合并胸腺增生患者52例，納入患者34例，其中OMG合并胸腺增生患者14例，GMG合并胸腺增生患者20例，Non-MG患者6例為對照一組，6例肺癌患者，胸腺處于成人萎縮狀態(tài)為對照二組，12例嬰兒胸腺為對照三組。
　　結果：
　　IHC結果顯

12、示，CD4和Foxp3的表達在胸腺增生是否合并MG患者及對照組的組間比較，未見明顯差異。CD25和CXCL13組間比較差異明顯：CD25高表達于嬰兒胸腺，在正常成人胸腺中也有表達，但較低，合并胸腺增生時最低。而在胸腺增生合并MG時則表達增高，尤其在合并GMG時表達最高。CXCL13在嬰兒胸腺、正常成人胸腺及胸腺增生時表達均較低，組間未見明顯差異。而在合并OMG時表達升高，GMG時表達最高。R-TPCR結果與IHC結果基本相似。相關性分析

13、發(fā)現(xiàn)，CD25和CXCL13的表達與MG患者病情中度相關。
　　結論：
　　合并胸腺增生時，OMG和GMG患者胸腺存在不同的分子表達，而嬰兒胸腺、成人萎縮胸腺及胸腺增生合并Non-MG時的分子表達也不同。研究提示，CD25水平降低可能與人類的衰老有關。CD25、CXCL13在MG合并胸腺增生患者的表達與MG患者臨床癥狀呈正相關。提示CD25、CXCL13可能是MG患者疾病嚴重性的一個標志物。
　　第三部分Tfh細胞在O

14、MG、GMG患者合并胸腺異常時的不同分子表達
　　目的：
　　1.CD4+CXCR5+T細胞在OMG、GMG合并胸腺瘤時的不同表達。
　　2.IHC、IF、WB、SNP與R-TPCR分析OMG、GMG合并胸腺瘤時CXCR5、Bcl-6、ICOS、IL-21表達的差異。
　　方法：
　　取2009～2011年唐都醫(yī)院MG合并胸腺瘤患者胸腺標本為研究對象，其中OMG合并胸腺異?；颊?1例，GMG合并胸腺異?；颊?/p>

15、18例，Non-MG合并胸腺異?；颊?9例為對照組。采用IHC、IF、R-TPCR、WB、SNP分析Tfh細胞在胸腺異常合并OMG、GMG患者胸腺的表達。本研究以CD4+CXCR5+代表Tfh細胞，激光掃描共聚焦顯微鏡（laserscanningconfocalmicroscope，LSCM）觀察Tfh細胞在不同組間的表達，SNP觀察有無堿基的突變，WB定量目標分子的蛋白水平、R-TPCR定量目標分子的轉錄水平。
　　結果：

16、>　　本研究發(fā)現(xiàn)，CD4+CXCR5+T細胞在GMG患者胸腺的表達最高，其次是在OMG患者胸腺表達，而在Non-MG的患者胸腺中，表達最低。WB技術及IHC技術分別定量、定位證明，ICOS、Bcl-6的表達在GMG組最高。SNP發(fā)現(xiàn)MG患者存在ICOS堿基的突變；而R-TPCR結果顯示，與正常成人胸腺對比，CXCR5、ICOS、Bcl-6的表達，在GMG組最高，其次是OMG組。而與Non-MG患者胸腺相比，OMG患者胸腺CXCR5、IC

17、OS、Bcl-6的表達未見明顯增高。IL-21在GMG組最高，充分說明GMG患者胸腺可能存在過度的B細胞活化使得抗體分泌增多，IL-21的表達同時在Non-MG患者胸腺表達增高，充分說明胸腺異?；颊進G的易感性增加。高表達IL-21可以作為MG發(fā)病的高危因素。
　　結論：
　　通過IHC、IF、WB、SNP、R-TPCR在不同層面論證了ICOS，Bcl-6和IL-21在GMG患者胸腺中CD4+CXCR5+T細胞表達均升高，且