新型壓電免疫傳感技術(shù)用于白血病等重大疾患診斷的研究.pdf

1、急性白血病的免疫分型即利用特定單克隆抗體識別白血病細(xì)胞分化抗原的一種臨床診斷手段,對于急性白血病的準(zhǔn)確診斷、治療方案的選擇、預(yù)后的判斷以及病因的探索等具有十分重要的意義。然而,目前臨床上采用的主要急性白血病免疫分型方法普遍表型速度慢、定量能力低、操作復(fù)雜、儀器昂貴且需要專業(yè)技能,尚只能在少數(shù)實(shí)驗室應(yīng)用。從而開發(fā)一些簡便、廉價、定量準(zhǔn)確且易于臨床推廣的免疫傳感分型技術(shù)是一件很有價值的工作。此外,近年來,一些人畜共患的傳染性疾病肆虐人類,特

2、別是一些原已得到控制的寄生蟲病又有死灰復(fù)燃的趨勢,其中以血吸蟲病和弓形蟲病最為典型,傳播廣泛且危害嚴(yán)重,成為世界上亟待解決的一個嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題。然而,當(dāng)今寄生蟲病的臨床診斷檢測方法,要么分析靈敏度低,要么操作繁瑣費(fèi)時,遠(yuǎn)不能滿足目前寄生蟲病防治工作的需要。因此,建立準(zhǔn)確、快速、方便攜帶于現(xiàn)場疾病篩查和突發(fā)性疫情監(jiān)控的寄生蟲病診斷技術(shù)成為當(dāng)務(wù)之急。
　　利用化學(xué)與生物傳感技術(shù)檢測疾病標(biāo)志物進(jìn)行臨床疾病的準(zhǔn)確、快速診斷以及流行病的現(xiàn)

3、場篩查與群體監(jiān)控,是當(dāng)前醫(yī)學(xué)上既新穎又極具吸引力的熱門研究課題之一。壓電聲波免疫傳感技術(shù)是結(jié)合了壓電效應(yīng)的高靈敏性和免疫反應(yīng)的高特異性的一種生物傳感技術(shù),可響應(yīng)晶體表面質(zhì)量負(fù)載以及體系(溶液)的密度、粘度、電導(dǎo)率、介電常數(shù)等多種信號變化。以簡便、快速、靈敏、響應(yīng)譜廣、成本低、毋需示蹤物標(biāo)記、免樣品純化、可進(jìn)行自動化實(shí)時數(shù)據(jù)輸出等優(yōu)點(diǎn),突破了以往分析方法的諸多“瓶頸”,在臨床疾病診斷的生化檢測方面顯示出誘人的應(yīng)用前景。本論文以急性白血病、

4、寄生蟲病(血吸蟲病和弓形蟲病)、Wilson病、惡性貧血癥、嚴(yán)重肝病等重大疾患標(biāo)志物為檢測對象或模式體系,一方面采用等離子體聚合膜(PPF)沉積技術(shù)、納米顆粒倍增的生物修飾技術(shù)以及聚電解質(zhì)自組裝吸附技術(shù)等,開發(fā)了一系列普適的免疫材料的固定化新程序,并構(gòu)建成壓電免疫傳感探針或陣列用于疾病的診斷檢測;另一方面,以功能化納米(或亞微米級)顆粒替代傳統(tǒng)膠乳修飾免疫識別分子,利用納米顆粒免疫凝集反應(yīng)和壓電非質(zhì)量效應(yīng)原理,凝集檢測了多種疾病標(biāo)志物。

5、此外,以亞微米級核-殼結(jié)構(gòu)磁性顆粒為載體修飾單抗,并借外加磁場的分離富集作用,實(shí)現(xiàn)了對目標(biāo)物自動化、高靈敏的傳感測定。具體內(nèi)容包括:
　　(1)首次研制了一種壓電免疫傳感陣列用于急性白血病的快速免疫分型(第2章)。采用氨基PPF膜和納米金修飾壓電晶體,用以分別固定白血病各亞型細(xì)胞特異的單抗片段,構(gòu)建成探針陣列檢測急性白血病細(xì)胞分化抗原。該陣列只需對樣品作一次表型分析,即能鑒別出白血病細(xì)胞與正常白細(xì)胞,并確定白血病細(xì)胞的亞型(系);

6、其定量檢測白細(xì)胞的濃度范圍為104～106ells mL-1;將之用于臨床樣品分析,得到的表型結(jié)果與臨床經(jīng)典免疫分型法的結(jié)果基本一致。
　　(2)開發(fā)了一種基于磁場免疫富集原理的急性白血病免疫傳感分型技術(shù)(第3章)。以SiO2包覆ZnFe2O4顆粒制得亞微米級核-殼型磁性顆粒,經(jīng)表面功能化后分別交聯(lián)白血病各亞型細(xì)胞特異的單抗,借助磁化單抗的免疫識別和外加磁場的分離與富集作用,以流動注射方式檢獲急性白血病細(xì)胞分化抗原。該傳感表型系統(tǒng)

7、能自動化、高靈敏地區(qū)分急性淋巴系和髓系白血病細(xì)胞,并確定其相應(yīng)的白血病亞型(系),可定量測定濃度數(shù)量級低至～103ells mL-1的白細(xì)胞。
　　(3)提出了一種高特異檢測弓形蟲IgG抗體的壓電免疫傳感技術(shù)(第4章)。以油包水微乳法制得納米SiO2顆粒并進(jìn)行化學(xué)活化,用以鍵合錨固弓形蟲抗原(TgAg)于氨基PPF膜修飾的傳感器表面。通過采用正常兔血清(NRS)和牛血清白蛋白(BSA)封閉其表面非特異性吸附位點(diǎn),并借琉基乙醇滅活樣

8、中抗體IgM成分,實(shí)現(xiàn)了對濃度稀釋比范圍1:5000～1:70弓形蟲IgG抗體的特異檢測。
　　(4)發(fā)展了一種納米金免疫凝集型壓電傳感技術(shù)用于弓形蟲全抗體的快速檢測(第5章)。以納米金替代傳統(tǒng)膠乳標(biāo)記TgAg,并采用“抗凝劑”肝素修飾壓電探針,用以直接響應(yīng)TgAg-Nanogold顆粒免疫凝集事件引起的溶液參數(shù)的變化。該傳感技術(shù)毋需固定活性組分和純化樣品,可快速檢測濃度稀釋比下限為～1:5500的兔血中弓形蟲全抗體,定量能力與經(jīng)

9、典ELISA法相接近。
　　(5)提出了一種可逆的日本血吸蟲病壓電免疫傳感診斷技術(shù)(第6章)。以氨基PPF膜覆蓋壓電晶體,并將此與組裝相反電荷的聚電解質(zhì)PSS結(jié)合起來,構(gòu)建成易于清除的界面以吸附固定血吸蟲抗原(SjAg),再借BSA和NRS試劑抑制背景非特性吸附的干擾,實(shí)現(xiàn)了對濃度范圍0.54～32.50μgmL-1血吸蟲抗體的定量測定。
　　(6)報道了一種簡便的SiO2顆粒免疫凝集分析技術(shù)用于日本血吸蟲病的快速篩查(第7

10、章)。以亞微米級SiO2顆粒為載體標(biāo)記SjAg,并以BSA封閉的壓電晶體為檢測探針,利用免疫凝集原理和壓電非質(zhì)量效應(yīng),直接響應(yīng)SjAg-SiO2顆粒與相應(yīng)抗體的免疫凝集反應(yīng)。結(jié)果表明,該技術(shù)可定量、快速地確定血清樣品的血吸蟲感染程度,適用于血吸蟲病臨床診斷、現(xiàn)場篩查和疫情監(jiān)控等。
　　(7)提出了一種高靈敏的銅藍(lán)蛋白壓電免疫傳感技術(shù)(第8章)。銅藍(lán)蛋白抗體通過褐藻酸鈉介導(dǎo)固定于氨基PPF膜修飾的壓電晶體表面，以聚乙二醇(PEG)為

11、免疫反應(yīng)促進(jìn)劑放大響應(yīng)信號(靈敏度)，實(shí)現(xiàn)了血清含量低至～0.15μg mL-1銅藍(lán)蛋白的測定，可基本滿足臨床診斷Wilson病的檢驗要求。
　　(8)研究了一種可更新的壓電免疫傳感器，用于惡性貧血標(biāo)志物轉(zhuǎn)鐵蛋白的測定(第9章)。采用氨基PPF膜修飾壓電晶體，通過組裝聚電解質(zhì)PSS以靜電吸附固定轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體。初步探討了PPF膜的形成與聚電解質(zhì)的自組裝機(jī)理。該傳感器測定轉(zhuǎn)鐵蛋白的線性濃度范圍為0.10～12.65 μg mL-1。同

12、時，通過改變?nèi)芤旱乃岫葪l件，可實(shí)現(xiàn)器件的反復(fù)再生。
　　(9)將納米金顆粒組裝于氨基PPF膜修飾的傳感器表面，發(fā)展了一種納米金界面吸附的生物分子固定化技術(shù)(第10章)。著重利用AFM形貌表征手段和壓電晶體的實(shí)時監(jiān)測功能，探討了納米金在氨基膜上自組裝過程及其動力學(xué)特性與機(jī)制。以該納米金界面固定抗體，具有蛋白固定量大、免疫活性強(qiáng)、操作穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)。
　　(10)開發(fā)了一種納米金-蛋白A介導(dǎo)的定向固定抗體的新程序(第11章)。采

13、用氨基PPF膜和納米金顆粒構(gòu)建成納米尺度的傳感基質(zhì)，用以吸附蛋白A介導(dǎo)抗體的定向固定化。該程序避免了傳統(tǒng)平板金電極引起的蛋白變性，顯著地提高了蛋白A固定化量及其生物活性。用于固定嚴(yán)重肝病標(biāo)志物觸珠蛋白的抗體，獲得了優(yōu)良的免疫傳感性能，可定量測定濃度下限～0.41nM的血清觸珠蛋白。
　　(11)構(gòu)建了一種納米顆粒倍增的抗體片段吸附免疫平臺(第12章)。以惡性腫瘤和糖尿病標(biāo)志物B因子的免疫體系為測試對象，將抗體還原成帶琉基的片段以定