應(yīng)用于白血病免疫分型芯片的外周血白細(xì)胞分離方法的研究.pdf

1、目的： 從全血中分離和純化白細(xì)胞是許多生物學(xué)和醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的基本方法，它廣泛被應(yīng)用于包括骨髓移植患者巨細(xì)胞病毒感染的早期診斷和白血病的免疫分型的診斷等許多方面。眾所周知，白細(xì)胞分離是許多生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的第一步，也是至關(guān)重要的一步，因?yàn)楹罄m(xù)的研究成果的可信度很大程度上取決于分離的白細(xì)胞活性與純度。因此對(duì)白細(xì)胞分離方法的研究成為當(dāng)血液學(xué)一個(gè)頗為熱點(diǎn)的研究課題。 目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道的分離白細(xì)胞的方法很多，包括密度梯度離心法、物理吸附法、

2、細(xì)胞電泳法、免疫磁珠法、流式細(xì)胞法等，其中有的分離方法所提取的細(xì)胞純度和細(xì)胞濃度已經(jīng)可以達(dá)到很高的標(biāo)準(zhǔn)。但這些方法只適用于單種白細(xì)胞或單個(gè)白細(xì)胞亞群的分離，而本實(shí)驗(yàn)研究的主要目的是為了尋找一種適用于白血病免疫分型芯片的細(xì)胞分離方法，它的最終結(jié)果是要將外周血中的全白細(xì)胞分離提取出來(lái)。 為了分離、提取形態(tài)及功能完整的全白細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)在既往細(xì)胞分離方法的基礎(chǔ)上作了改進(jìn)，根據(jù)等密度梯度離心原理，通過(guò)改變細(xì)胞分離液比重及滲透壓自制了一種全

3、白細(xì)胞分離液，經(jīng)過(guò)我們反復(fù)對(duì)全白細(xì)胞分離液條件探索以期達(dá)到一次性分離全白細(xì)胞的目的。 方法: 1、全白細(xì)胞分離液的配制右旋糖苷(或聚蔗糖)和泛影葡胺按不同比例混合配制成1.108g/ml、1.110g/ml、1.112g/ml、1.113g/ml四種比重分離液，并且在不同比重的分離液中分別加入五種不同濃度的氯化鈉來(lái)調(diào)節(jié)分離液滲透壓。 2、全白細(xì)胞分離液最佳比重及最佳滲透壓探索取50例正常外周血標(biāo)本，采用四種比重五

4、種滲透壓全白細(xì)胞分離液，比較分離效果，篩選分離液的最佳滲透壓和最佳比重。細(xì)胞分離效果測(cè)定參數(shù)為自細(xì)胞回收率、紅細(xì)胞去除率和各種白細(xì)胞比例三方面。 3、兩種全白細(xì)胞分離液比較取20例正常外周血標(biāo)本，通過(guò)我們配制的兩種全白細(xì)胞分離液(Dextran-全白細(xì)胞分離液和Ficoll-全白細(xì)胞分離液)對(duì)白細(xì)胞分離效果進(jìn)行比較，篩選最佳全白細(xì)胞分離液。細(xì)胞分離效果比較參數(shù)為細(xì)胞濃度，細(xì)胞純度，細(xì)胞活性。 4、全白細(xì)胞分離液適用的芯片

5、上固定抗體濃度確定將原始濃度為0.2mg/ml的單克隆抗體按比例1∶2；1∶4；1∶8；1∶16稀釋，用MicroGrid Ⅱ芯片點(diǎn)樣儀將其點(diǎn)在氨基硅烷-醛基修飾的玻片上，制備單克隆微陣列；然后用全白細(xì)胞分離液分離提取白細(xì)胞，制備白細(xì)胞懸液；經(jīng)過(guò)吖叮橙染色后孵育芯片；通過(guò)掃描儀掃描及顯微鏡觀察結(jié)果比較篩選芯片上固定抗體濃度。 5、全白細(xì)胞分離液對(duì)正常血細(xì)胞的分離及芯片對(duì)細(xì)胞分離結(jié)果的檢測(cè)取臨床50例正常外周血標(biāo)本，首先用全白細(xì)胞

6、分離液進(jìn)行白細(xì)胞分離，芯片孵育及細(xì)胞染色，然后通過(guò)對(duì)顯微鏡下各抗體點(diǎn)捕獲細(xì)胞形態(tài)觀察和數(shù)量統(tǒng)計(jì)，檢測(cè)全白細(xì)胞分離液分離白細(xì)胞效果。 6、全白細(xì)胞分離液對(duì)白血病細(xì)胞的分離及其在白血病免疫分型芯片的應(yīng)用通過(guò)全白細(xì)胞分離液對(duì)10例白血病標(biāo)本的分離及芯片對(duì)白血病細(xì)胞捕獲，檢測(cè)全白細(xì)胞分離液對(duì)腫瘤細(xì)胞分離效果。 結(jié)論: 本實(shí)驗(yàn)自制的全白細(xì)胞分離液成功地分離全白細(xì)胞。所獲得的細(xì)胞濃度及細(xì)胞純度高，細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞活性保持良好，