白血病免疫分型細(xì)胞芯片捕獲細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)研究.pdf

1、目的: 生物芯片誕生于上世紀(jì)90年代初，是近年來高新技術(shù)領(lǐng)域中極具時(shí)代特征的重大進(jìn)展，是物理學(xué)、微電子學(xué)與分子生物學(xué)綜合交叉形成的高新技術(shù)。被廣泛應(yīng)用于疾病診斷等多方面。目前，白血病的免疫分型診斷主要依靠用已知的單克隆抗體(McAb)去鑒定白血病細(xì)胞表面或胞漿抗原-CD抗原，根據(jù)不同抗原在不同階段的出現(xiàn)與消失，決定白細(xì)胞所屬的系列及分化階段，做出免疫學(xué)診斷。 本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的白血病免疫學(xué)分型細(xì)胞芯片就是利用抗原、抗體特異性

2、結(jié)合的原理，將白細(xì)胞表面分化抗原單克隆抗體固定于載體上，形成抗體點(diǎn)陣。不同的單克隆抗體能夠自動(dòng)識(shí)別和捕獲表達(dá)相應(yīng)表面分化抗原的細(xì)胞，從而對(duì)白血病進(jìn)行免疫學(xué)分型。這種對(duì)白血病進(jìn)行免疫學(xué)分型的方法較免疫細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞儀檢測法具有高通量、使用簡便、樣品用量少、檢測速度快、靈敏度高、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。 但是，白血病免疫分型細(xì)胞芯片作為一種新型的方法，需要傳統(tǒng)公認(rèn)的免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)的驗(yàn)證。另外，白血病免疫分型的檢測，需要細(xì)胞

3、表面抗原和胞漿抗原的檢測，尤其是在雙表型檢測及特殊表型的檢測時(shí)，胞內(nèi)抗原的檢測更是十分重要的。澳大利亞悉尼大學(xué)醫(yī)學(xué)研究所的Larssa Belov等所研制的白血病免疫分型抗體微陣列，僅能檢測細(xì)胞表面分化抗原，而我們實(shí)驗(yàn)室所研制的芯片以具有透明性的玻璃為載體，在表達(dá)相應(yīng)CD抗原的白細(xì)胞與芯片上的抗體結(jié)合后，在其上用免疫細(xì)胞化學(xué)，來檢測胞漿內(nèi)的分化抗原，將結(jié)果直觀、穩(wěn)定的表現(xiàn)出來，為臨床診斷提供更快速、簡便、完善、準(zhǔn)確的白血病免疫分型診斷方

4、法。 方法: 1、確定芯片上捕獲細(xì)胞的最佳固定方法 制備細(xì)胞芯片，室溫條件下，分別用下列固定劑固定(1)甲醇：丙酮(1：1v/v)90秒；(2)95％乙醇3分鐘；(3)95％乙醇：冰醋酸(AA液95：5v/v)3分鐘；(4)AF液(95％乙醇：甲醛：水=68.4：10：21.6v/v)1分鐘。除AF液固定后用蒸餾水洗2遍外，其余固定劑固定后芯片自然風(fēng)干。免疫細(xì)胞化學(xué)后顯微鏡下觀察點(diǎn)陣捕獲的細(xì)胞形態(tài)、抗原的表現(xiàn)情況

5、、細(xì)胞核復(fù)染著色情況及計(jì)數(shù)固定前后細(xì)胞數(shù)量。 2、確定細(xì)胞芯片上的免疫細(xì)胞化學(xué)所用單克隆抗體的最佳濃度 在相同條件下，細(xì)胞芯片上細(xì)胞用最佳固定方法固定，進(jìn)行酶標(biāo)免疫細(xì)胞化學(xué)，第一抗體抗CD7、抗CD13、抗CD19、抗MPO濃度分別為4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml，陰性對(duì)照滴加等量PBS，室溫下孵育1小時(shí)；DAB顯色，顯微鏡下觀察結(jié)果。 3、用免疫細(xì)胞化學(xué)法染色細(xì)胞

6、芯片捕獲細(xì)胞的胞膜及胞漿 抗原細(xì)胞芯片，用最佳方法固定，按1μg/ml最佳濃度稀釋免疫細(xì)胞化學(xué)第一抗體羊抗人抗CD7、抗CD13、抗CD19、抗MPO，陰性對(duì)照用PBS緩沖液代替第一抗體，免疫細(xì)胞化學(xué)染色后，顯微鏡下觀察結(jié)果。 4、檢測細(xì)胞芯片捕獲細(xì)胞的特異性 細(xì)胞芯片用最佳方法固定，按1μg/ml最佳濃度稀釋免疫細(xì)胞化學(xué)第一抗體抗CD7、抗CD13、抗CD19，陰性對(duì)照用PBS緩沖液代替第一抗體，進(jìn)行免疫細(xì)胞化

7、學(xué)操作后，顯微鏡下每種抗體點(diǎn)上取三個(gè)高倍鏡視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)和有棕色顆粒的陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽性率。 5、應(yīng)用細(xì)胞芯片進(jìn)行白血病免疫分型并用免疫細(xì)胞化學(xué)法驗(yàn)證特異性 制備應(yīng)用于白血病免疫分型的細(xì)胞芯片，從白血病患者的外周血中提取白細(xì)胞，吖叮橙染色，孵育芯片，PBS清洗，掃描，檢測信號(hào)，得到白血病免疫分型結(jié)果。再用免疫細(xì)胞化學(xué)驗(yàn)證。 結(jié)果: 1、細(xì)胞芯片捕獲細(xì)胞的固定方法以AF液(95％乙醇：甲醛：水=68.

8、4：10：21.6v/v)1分鐘最佳。 2、細(xì)胞芯片上的免疫細(xì)胞化學(xué)所用單克隆抗體的濃度以1μg/ml室溫下孵育1小時(shí)最佳。 3、細(xì)胞芯片上免疫細(xì)胞化學(xué)第一抗體為抗CD7、抗CD13、抗CD19時(shí)，棕色顆粒在細(xì)胞膜上；第一抗體為抗MPO時(shí)棕色顆粒在胞漿中。 4、細(xì)胞芯片的特異性捕獲陽性率在96.7±0.4％以上，非特異性捕獲陽性率在0.8±0.3％以下，具有明顯的特異性。 5、白血病細(xì)胞芯片的特異性捕獲陽

9、性率在97.4±0.2％以上，具有明顯的特異性。 結(jié)論： 1、白血病免疫分型芯片捕獲細(xì)胞的固定用AF液(95％乙醇：甲醛：水=68.4：10：21.6v/v)室溫下固定1分鐘最佳。 2、免疫細(xì)胞化學(xué)第一抗體以1μg/ml室溫下孵育1小時(shí)為最佳。 3、芯片捕獲細(xì)胞用免疫細(xì)胞化學(xué)法將胞漿、胞膜抗原染色出來。 4、用免疫細(xì)胞化學(xué)法驗(yàn)證細(xì)胞芯片捕獲細(xì)胞具有高度特異性。 5、用白血病免疫分型細(xì)胞芯片