靶向VEGF的miR-126在結直腸癌侵襲和血管生成過程中的調控作用.pdf

1、研究背景和目的:
　　 腫瘤轉移播散一直是腫瘤治療研究中的一大難題。腫瘤細胞從原發(fā)灶脫離，侵入間質，內滲進入血管，隨血流到達遠處器官組織定植，繼續(xù)增殖成瘤，多器官受累加速患者死亡。單就結直腸癌而言，50％的癌灶會發(fā)生遠處轉移。結直腸癌導致的患者死亡，90％是由于腫瘤的轉移播散引起。腫瘤血管生成是腫瘤轉移過程中的關鍵性事件，抑制腫瘤血管生成能顯著地抑制腫瘤的生長和轉移。抗腫瘤血管生成是不同于常規(guī)抗腫瘤治療的新策略。
　　

2、血管內皮生長因子(VEGF)及其受體調控途徑則是腫瘤血管形成的核心因素。在結直腸癌的發(fā)展過程中，VEGF的作用尤為突出。VEGF在結直腸癌組織中表達水平顯著高于癌旁正常粘膜，且表達水平與腫瘤大小顯著相關。高表達的VEGF不但促進腫瘤血管新生，而且與結直腸癌的浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移和Dukes分期呈正相關。VEGF受體家族廣泛表達于瘤細胞及間質血管內皮細胞，進一步說明VEGF及其受體信號通路促進結直腸癌的發(fā)展和轉移。近年，針對VE

3、GF及其受體的靶向治療已經成為抗腫瘤治療的重要策略。如人源化VEGF單抗bevacizumab，其聯(lián)合化療藥物常被用作治療轉移性結直腸癌的一線方案。另外還有可抑制VEGFR酪氨酸激酶的藥物sunitinib和sorafenib等。microRNA在人體組織中廣泛表達，對30％的編碼基因行使調節(jié)功能，對增殖、分化、死亡等基本細胞過程具有重要的調控作用。近期，在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)有不同microRNA的異常表達，說明特異性的microRNA與腫

4、瘤發(fā)生有密切聯(lián)系。它們可能扮演致癌基因或者抑癌基因的角色，這取決于它們作用的靶基因。一些具有促癌或者抑癌作用的microRNA連同它們的靶基因已經相繼被鑒定出來。例如，在結直腸癌中，miR-143的表達降低是KRAS持續(xù)激活并促進惡性轉化的重要原因;miR-135則可以抑制APC的表達，異常激活WNT通路。這可能是除APC基因突變以外存在的另一種APC失調的情況。
　　 作為明確的促癌因子，VEGF是microRNA的調控靶點。

5、miR-126可以通過抑制SPRED1、PIK3R2，解除二者對VEGF信號途徑的抑制，促進胚胎血管形成并維持管壁的完整性。VEGF可以增加miR-296的表達，靶向抑制HGS，解除其對PDGFR和VEGFR2的抑制，提高VEGF的作用效率，促進腫瘤血管生成，形成一個正反饋路徑。這些研究均提示，microRNA對以VEGF及其受體為中心的腫瘤血管生成過程具有重要的調控作用，調節(jié)某些特異性microRNA的表達可能成為抗VEGF治療的新手

6、段。
　　 我們在前期的生物信息學分析中發(fā)現(xiàn)，VEGF是miR-126的預測靶基因。本研究希望通過體外實驗鑒定直腸癌中miR-126——VEGF這一靶向調控關系的存在，并進一步探討miR-126表達缺失的原因，及其對VEGF介導的結直腸癌腫瘤血管生成和轉移過程的調控機制。
　　 研究方法和結果:
　　 1.miR-126在結直腸癌中的表達異常降低
　　 采用Taqman探針熒光定量PCR法檢測了12對結直

7、腸癌組織以及6種結直腸癌細胞株中成熟miR-126的表達水平。結果顯示，腫瘤組織中的miR-126表達水平與其相應的癌旁正常粘膜相比，均顯著下降。其在6種細胞系中的表達水平也顯著低于正常對照(P＜0.05)。
　　 2.恢復結直腸癌細胞中miR-126的表達水平能夠抑制VEGF的表達
　　 采用lipofectmin2000轉染miR-126的precusors進入LoVo和SW620細胞株，以恢復miR-126的表達。

8、Western blot結果顯示，與陰性對照相比，腫瘤細胞中miR-126表達水平恢復后，VEGF的表達受到了顯著抑制。但RT-PCR的結果中卻沒有發(fā)現(xiàn)VEGF的mRNA表達水平變化有統(tǒng)計學差異。提示這種抑制作用可能是在蛋白翻譯水平產生的。
　　 3.miR-126通過與VEGF mRNA3'UTR結合而直接調控VEGF表達
　　 生物信息學預測在VEGF mRNA3'UTR中含有一個可與miR-126互補結合的位點。我

9、們分別構建了含有野生型和突變型結合位點序列的熒光素酶報告基因(VEGF3'UTR/ mut VEGF3'UTR)，將它們和miR-126的precursors或者scramble共轉染進入HEK293細胞中，檢測細胞的熒光素酶活性。共轉染miR-126 precursors/VEGF3'UTR的HEK293細胞，其熒光素酶活性顯著低于共轉染miR-126 scramble/VEGF3'UTR的細胞，而共轉染miR-126 precurs

10、ors/mutVEGF3'UTR則可以抵消共轉染miR-126 precursors/VEGF3'UTR引起的熒光素酶活性降低。此結果說明，miR-126確實是通過與VEGF mRNA的3'UTR直接結合，從而遏制VEGF的蛋白翻譯過程。
　　 4.恢復miR-126表達可抑制結直腸癌細胞的遷移及侵襲能力，但不影響其增殖
　　 利用alarmar blue法檢測LoVo和SW620細胞恢復miR-126表達后細胞的增殖能

11、力變化。實驗分組為:未處理組(blank)、陰性對照組（scramble）和處理組(pre-miR-126)，每組分別檢測細胞轉染處理后24h、48h和72h三個時間點的細胞活性。結果顯示，轉染處理后的72h內，不同處理組的LoVo或SW620細胞之間，其增殖能力均未出現(xiàn)差異變化(P＞0.05)。提示miR-126并不參與結直腸癌細胞的增殖調控。運用Transwell實驗，檢測結直腸癌細胞在miR-126表達水平恢復后，其細胞運動能力，

12、即遷移能力和侵襲能力的改變。處理分組同增值實驗，細胞轉染處理24h后，將細胞消化重懸加入Transwell裝置上室（侵襲試驗上室預鋪基質膠Matrigel），下室為含20％FBS的新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)48h后，計數(shù)上室濾膜下表面的細胞數(shù)。結果顯示，恢復miR-126后的結直腸癌細胞，其遷移和侵襲能力相比未處理和陰性對照處理組均顯著減弱(P＜0.05)。
　　 5.恢復miR-126的表達能夠抑制結直腸癌細胞通過分泌VEGF誘導的腫瘤

13、血管形成
　　 轉染precusors恢復LoVo細胞中miR-126的表達水平，在轉染后48h取細胞培養(yǎng)基檢測其中VEGF的濃度。結果在10nM、30nM和30nM的轉染濃度下，LoVo細胞培養(yǎng)基中的VEGF濃度3.61±0.08 ng/ml、3.05±0.08 ng/ml和2.68±0.11 ng/nl均顯著低于未處理組(blank)的4.12±0.18 ng/ml和陰性對照組（scramble）的3.99±0.10 ng/

14、ml(P＜0.05)。內皮細胞遷移實驗中，在transwell體系中將人微血管內皮細胞（HMVEC）和經過轉染處理的LoVo細胞共培養(yǎng)24h后，計數(shù)上室濾膜下表面的細胞數(shù)。結果顯示，與恢復了miR-126表達的LoVo細胞(pre-miR-126)共培養(yǎng)的HMVEC細胞，其遷移能力顯著低于與未處理組(blank)和陰性對照組(scramble) LoVo細胞共培養(yǎng)的HMVEC細胞(P＜0.05)。體外的小管形成實驗中，在LoVo細胞轉染

15、后的48h，收集未處理組(blank)、陰性處理組（scramble）和處理組（pre-miR-126）的細胞培養(yǎng)基，用以重懸HMVEC細胞，以0.5×104/well數(shù)量將HMVEC種入預鋪Matrigel基質膠的96孔板中。37℃孵育細胞12h，顯微鏡下計數(shù)HMVEC形成的完整封閉的環(huán)狀結構。結果表明，處理組培養(yǎng)基刺激HMVEC細胞形成小管的能力顯著地弱于未處理組和陰性處理組。進一步利用雞胚絨毛膜尿囊實驗模型評估m(xù)iR-126表達水

16、平對于體內腫瘤血管生成能力的影響。以無菌明膠海面為載體，分別攜帶各組上述收集到的培養(yǎng)基，將載體置于雞胚絨毛尿囊膜血管稀疏部位，計算以載體為中心向四周放射狀生成的毛細血管數(shù)，以此評價血管新生能力。結果與體外實驗結果近似，處理組培養(yǎng)基(pre-miR-126)刺激雞胚血管新生的能力顯著弱于未處理組(blank)和陰性對照組(scramble)(P＜0.05)。
　　 6.啟動子甲基化是結直腸癌中miR-126的表達缺失的重要原因

17、r>　　 采用MSP方法檢測結直腸癌組織中miR-126啟動子區(qū)的甲基化修飾情況。被檢測的62例結直腸癌組織中，有50例在miR-126啟動子區(qū)有甲基化修飾存在。而對6種結直腸癌細胞株的MSP檢測結果則顯示，6種細胞株均受不同程度的甲基化修飾。進一步的BSP測序結果與MSP結果符合，各細胞株miR-126啟動子區(qū)CpG島內的CG二核苷酸均有較高頻率地甲基化修飾。使用甲基轉移酶抑制劑5-aza-CdR處理六種細胞株，使其啟動子區(qū)去甲基化

18、后收集細胞，利用real time-PCR檢測miR-126的表達情況，并用western blot檢測VEGF的表達變化。結果發(fā)現(xiàn)，經去甲基化處理后，各細胞株中miR-126的表達水平均有顯著提高，而隨著miR-126表達的上調，VEGF的表達也受到相應抑制。提示啟動子區(qū)的甲基化是使得結直腸癌中miR-126表達異常降低甚至缺失的重要原因，并且是結直腸癌中VEGF表達異常增高的原因之一。
　　 結論:
　　 本研究證實