miR-200a及其甲基化在結(jié)直腸癌中的作用研究.pdf

1、研究背景:結(jié)直腸癌是我國最常見的、對人類健康危害最大的惡性腫瘤之一。近年來，隨著人們生活水平的提高，生活習(xí)慣的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐年上升。結(jié)直腸癌根治術(shù)治療效果顯著，但由于癌組織在早期已經(jīng)發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，它仍然對患者的生命健康具有極大威脅。因此，探討結(jié)直腸癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的機(jī)制，仍是腫瘤學(xué)的迫切任務(wù)。
　　 甲基化是真核細(xì)胞中DNA正常的修飾方式。在正常發(fā)育的早期階段，甲基化和去甲基化的交替進(jìn)行是細(xì)胞得以生長和分化的關(guān)鍵程序，在

2、保持細(xì)胞基因組穩(wěn)定性中甲基化也起著至關(guān)重要的作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在許多人類腫瘤中也有不同程度的DNA異常甲基化現(xiàn)象。啟動(dòng)子區(qū)CpG島發(fā)生異常高甲基化可導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄沉默，使抑癌基因、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因、凋亡基因等表達(dá)極度降低或不表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在許多惡性腫瘤的癌前病變中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)抑癌基因的CpG島高甲基化。這說明，啟動(dòng)子區(qū)CpG島高甲基化在腫瘤的早期階段已存在。
　　 DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)是DNA甲基化發(fā)生、完成、

3、持續(xù)的重要作用酶。目前發(fā)現(xiàn)的DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶主要有四種即DnmT1、DnmT2、DnmT3a、DnmT3b。研究表明，DNMT1主要作用是對新合成的DNA鏈進(jìn)行甲基化修飾并維持，在乳腺癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤中均表達(dá)異常增高，并與腫瘤的分化程度、臨床分期或（和）預(yù)后不良有不同程度的相關(guān)性。DNMT1過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致多種基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化。
　　 近年來微小RNA(microRNA，miRNA)逐漸被研究者重視，成為腫瘤研

4、究的熱點(diǎn)。miRNA是真核生物細(xì)胞中一類長度約為18-24核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA。它由DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，但并不翻譯蛋白質(zhì)，而是在蛋白質(zhì)合成中起調(diào)節(jié)其他基因的功能，是調(diào)控其他蛋白質(zhì)編碼基因的基因。它通過非特異性結(jié)合位點(diǎn)的作用，可以對多個(gè)基因經(jīng)行一對多、多對一的調(diào)控作用。因此，對miRNA特別是成家族的miRNA的檢測較之單個(gè)基因的檢測，在腫瘤的煙酒及之中更具前瞻性意義。miR-200家族是近年來研究的熱點(diǎn)，miR-200a作為mi

5、R-200家族（包括miR-200a, miR-200b，miR-200c，miR-114，miR-429）的一員在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，主要通過調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程，對腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移起關(guān)鍵作用。本課題組在前期的工作中對miR-200a在結(jié)直腸癌新鮮組織中的表達(dá)進(jìn)行了小樣本量的檢測。檢測結(jié)果表明，miR-200a的表達(dá)與結(jié)直腸癌的分化程度具有相關(guān)性。在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的檢測表明miR-200a可以調(diào)控細(xì)胞的EMT現(xiàn)象。在前期工

6、作的基礎(chǔ)上，為了深入了解miR-200a在結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，探尋miR-200家族啟動(dòng)子區(qū)域甲基化與結(jié)直腸癌浸潤轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，擬進(jìn)一步進(jìn)行如下研究。
　　 研究內(nèi)容:
　　 1.檢測HCT116、HT29、LS174t、SW480、SW620、Lovo這6株細(xì)胞中miR-200家族啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，分析其與臨床分期、分化程度及預(yù)后的相關(guān)性;同時(shí)進(jìn)行miR-200家族甲基化程度與患者生存相關(guān)與分析;
　　

7、 2.對HCT116、HT29細(xì)胞使用抑制miR-200a處理，對SW620、Lovo細(xì)胞使用過表達(dá)miR-200a處理，檢測miR-200a表達(dá)量改變對細(xì)胞運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)移能力和DNMT1表達(dá)的影響;
　　 3.對HCT116、HT29細(xì)胞使用抑制miR-200a處理，激活TGF-β通路處理，對SW620、Lovo細(xì)胞使用過表達(dá)miR-200a處理，抑制ERK通路，通過免疫印跡方法檢測通路中標(biāo)志物TβRⅡ、p-ERK表達(dá)量，探討mi

8、R-200a對DNMT1調(diào)控的作用機(jī)制。
　　 4.在HCT116、HT29、SW620和Lovo四株細(xì)胞中分別下調(diào)和上調(diào)miR-200a，檢測TGF-β1表達(dá)量，并通過生物信息學(xué)分析，尋找miR-200a與TGF-β通路可能存在的調(diào)控靶點(diǎn)。
　　 結(jié)果:
　　 1.BSP方法檢測結(jié)果顯示，六株不同惡性程度的結(jié)直腸癌細(xì)胞株中miR-200家族啟動(dòng)子甲基化程度不同，并且其甲基化程度與細(xì)胞惡性程度成反比，與細(xì)胞株中m

9、iR-200a表達(dá)量的檢測結(jié)果一致。MSP方法檢測顯示，在138例結(jié)直腸癌組織中miR-200家族啟動(dòng)子甲基化程度與患者年齡無關(guān)，與患者性別(F=6.834，P=0.033)、腫瘤最大直徑(F=11.310，P=0.003)、淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(F=23.929，P=0.000)及患者術(shù)后生存時(shí)間相關(guān);完全甲基化病例三年生存率明顯低于未甲基化和部分甲基化病例(x2=8.967，P=0.01)，未甲基化和部分甲基化病例之間無明顯差異;完全甲

10、基化病例五年生存率明顯低于未甲基化和部分甲基化病例(x2=24.934，P=0.000)，部分甲基化病例低于未甲基化病例(x2=18.271，P=0.000)。
　　 2.對miR-200a高表達(dá)的HT29和HCT116細(xì)胞進(jìn)行miR-200a的抑制后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測48h抑制效率分別約為50.9％和54.4％。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，HT29和HCT116細(xì)胞的下調(diào)miR-200a組在mRNA水平DNMT1表達(dá)

11、顯著升高(F=38.278，P=0.000)(F=21.433，P=0.002); Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HT29和HCT116細(xì)胞的下調(diào)miR-200a組的DNMT1在蛋白水平表達(dá)量顯著升高。劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，HT29和HCT116細(xì)胞的下調(diào)miR-200a組的遷移能力較對照組顯著增強(qiáng);Transwell小室細(xì)胞運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HT29和HCT116細(xì)胞的下調(diào)miR-200a組穿膜數(shù)量較對照組顯著增多。
　　 3

12、.對miR-200a低表達(dá)的SW620和Lovo細(xì)胞進(jìn)行miR-200a的過表達(dá)后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測48h miR-200a/mimics組表達(dá)倍數(shù)為negative control組2053倍和1020倍。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示， SW620和LoVo細(xì)胞的上調(diào)miR-200a組在mRNA水平DNMT1表達(dá)顯著下降（F=19.221，P=0.005）(F=29.498，P=0.000);Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯

13、示，SW620和LoVo細(xì)胞的上調(diào)miR-200a組的DNMT1在蛋白水平表達(dá)量顯著降低。劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，SW620和LoVo細(xì)胞的上調(diào)miR-200a組的遷移能力較陰性對照組顯著減弱。Transwell小室細(xì)胞運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SW620和LoVo細(xì)胞的上調(diào)miR-200a組的穿膜數(shù)量較對照組顯著減少。
　　 4.對HCT116和HT29細(xì)胞進(jìn)行TGF-β1激活TGF-β通路處理，對SW620和LoVo細(xì)胞進(jìn)行U0126抑制ER

14、K通路處理。通過免疫印跡方法檢測通路中標(biāo)志物表達(dá)量。結(jié)果顯示:TGF-β誘導(dǎo)組的TβRⅡ、p-ERK1/2表達(dá)量比其空白表達(dá)增強(qiáng);在SW620和Lovo細(xì)胞中，U0126抑制組的p-ERK1/2表達(dá)量比其空白組表達(dá)減弱，而TβRⅡ表達(dá)量沒有變化。
　　 5.在HCT116、HT29、SW620和Lovo四株細(xì)胞中分別下調(diào)和上調(diào)miR-200a，檢測TGF-β1表達(dá)量。結(jié)果顯示:四株細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組與對照組的TGF-β1表達(dá)量差異不具

15、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 6.通過軟件http://www.targetscan.org/預(yù)測到TGF-β亞型中的TGF-β2與miR-200a存在兩個(gè)8bp的結(jié)合位點(diǎn)。miR-200a可能通過這兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)對TGF-β通路的調(diào)控。
　　 結(jié)論:
　　 1.miR-200家族的表達(dá)受到甲基化修飾的調(diào)控，并且此調(diào)控成為影響表達(dá)量的主要原因。miR-200家族啟動(dòng)子區(qū)域甲基化與患者年齡不具相關(guān)性，與患者性別，腫瘤大小

16、，是否發(fā)生轉(zhuǎn)移以及預(yù)后具有相關(guān)性。
　　 2.miR-200家族甲基化程度與結(jié)直腸癌患者生存期密切相關(guān)，可以作為預(yù)后指標(biāo)。
　　 3.結(jié)直腸癌細(xì)胞株中miR-200a表達(dá)量降低促使癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，基因組甲基化能力增強(qiáng)。
　　 4.結(jié)直腸癌細(xì)胞株中miR-200a表達(dá)量升高促使癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)移能力減弱，基因組甲基化能力減弱。
　　 5.miR-200a可以通過TGF-β—ERK通路實(shí)現(xiàn)對DNMT1