脂多糖誘導(dǎo)的ALI-ARDS小鼠肺組織microRNA表達(dá)譜的初步研究.pdf

1、研究背景:
　　 急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是由Ashbaugh和他的同事在1967年首次報(bào)道的，最初命名為成人呼吸窘迫綜合征(adult respiratory distress syndrome，ARDS)，但由于該病在小兒亦可出現(xiàn)，因此1994年美歐ARDS聯(lián)席會(huì)議(AECC)決定將其更名為急性呼吸窘迫綜合征。ARDS是急性肺損傷（acute lu

2、ng injury， ALI）的嚴(yán)重表現(xiàn)形式，ALI/ARDS是繼發(fā)于非心源性疾病的嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)疾病，由于現(xiàn)代復(fù)蘇技術(shù)和危重疾病早期搶救水平的提高，危重病人早期死亡率降低，ALI/ARDS發(fā)病率卻隨之增加，兒童重癥監(jiān)護(hù)室(PICU)中的發(fā)病率約為1.0％-4.2％。雖然肺保護(hù)性通氣策略等現(xiàn)代治療手段可以在一定程度上改善通氣血流比例失調(diào)，改善氧供，但并不能降低ALI/ARDS死亡率，ALI/ARDS仍是PICU中威脅兒童生命的重要原因之一

3、，死亡率高達(dá)54.6％-62.9％。
　　 ALI/ARDS是以彌漫性肺細(xì)胞損傷為基礎(chǔ)，以肺血管損傷所致的肺水腫和肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為其病理特征，臨床上以嚴(yán)重的低氧血癥、彌漫性肺浸潤(rùn)和肺水腫為主要特征的疾病。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尚未完全明確，但目前認(rèn)為主要包括以下幾方面:1、肺水腫的形成。普遍認(rèn)為由兩方面因素所導(dǎo)致:一方面是由于肺泡上皮和毛細(xì)血管上皮通透性增加，其肺泡液轉(zhuǎn)運(yùn)功能受損，使得蛋白水腫液聚集在肺泡腔內(nèi);另一方面是水通道蛋白

4、的數(shù)量和功能的異常。水通道蛋白主要包括AQP-1、AQP-3、AQP-4和AQP-5。其中AQP-1對(duì)肺內(nèi)液體的吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)方面起重要的作用。ALI/ARDS的發(fā)生過程中，肺泡Ⅱ型細(xì)胞上AQP-1的表達(dá)減少，造成肺間質(zhì)和肺泡內(nèi)的水經(jīng)由水通道蛋白重吸收的減少，水在肺間質(zhì)和肺泡聚集形成肺水腫。2、肺組織廣泛而過度的炎性反應(yīng)。ALI/ARDS的本質(zhì)就是炎癥反應(yīng)失控，諸多實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明多形核白細(xì)胞(PMN)在絕大多數(shù)ALI/ARDS的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)

5、鍵作用。PMN介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)、蛋白水解酶釋放及其細(xì)胞毒素使肺血管內(nèi)皮和肺泡上皮受損，大量富含蛋白的液體進(jìn)入肺組織，導(dǎo)致肺水腫、透明膜的形成及肺泡塌陷。此外，細(xì)胞因子的大量釋放、促炎因子與抗炎因子失衡，均是導(dǎo)致ALI/ARDS的重要原因。3、Ⅱ型肺泡上皮受損使表面活性物質(zhì)合成減少，成分改變。肺表面活性物質(zhì)在肺泡液-氣界面形成單分子層，起到降低肺泡表面張力的作用，對(duì)維持肺泡正常結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定通氣具有重要作用。因此，肺表面活性物質(zhì)減少或成分改

6、變均會(huì)導(dǎo)致肺泡塌陷，出現(xiàn)低氧血癥等嚴(yán)重癥狀。4、凝血功能異常:ALI/ARDS發(fā)展過程中在凝血及纖溶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的失調(diào)已經(jīng)被證實(shí)，ALI/ARDS患者肺血管內(nèi)常出現(xiàn)血小板纖維素性微血栓，血管外纖維素沉著，這可能是ALI/ARDS患者頻發(fā)多器官功能衰竭的重要原因，研究還發(fā)現(xiàn)彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)與病程嚴(yán)重程度相關(guān)。
　　 ALI/ARDS尚無(wú)特效治療手段，目前臨床上多根據(jù)其病理生理改變和臨床表現(xiàn)，采取綜合性治療措施。主要治療措施有

7、:1、積極治療原發(fā)病及全身營(yíng)養(yǎng)支持:盡早去除或控制致病因素，遏制其誘導(dǎo)的全身失控性炎癥反應(yīng)是ALI/ARDS病因治療的首要措施。全身綜合支持治療，如預(yù)防感染、營(yíng)養(yǎng)支持、胃腸道保護(hù)、預(yù)防血栓栓塞等可以防止患者病情加重甚至多器官功能障礙綜合征的發(fā)生。
　　 2、機(jī)械通氣治療:通氣療法是糾正缺氧的主要措施。近年來，通氣療法取得了顯著的進(jìn)步，特別是肺保護(hù)性通氣策略（小潮氣量:6 ml.kg-1）可以有效的改善肺泡通氣、提高PaO2、改善

8、動(dòng)脈氧合，并且能避免呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷的發(fā)生。3、一些藥物，如外源性肺表面活性物質(zhì)、糖皮質(zhì)激素、蛋白酶抑制劑、祛痰藥物等，在改善通氣血流比例，改善血氧方面也起著一定作用，但這些藥物并不能降低ALI/ARDS病人的死亡率。
　　 自1993年，Lee等在秀麗新小桿線蟲中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)microRNA(miRNA)以來，miRNA一直是各領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，2002年，更是被美國(guó)著名雜志《Science》評(píng)為十大科技突破的第一條。miRN

9、A是一類非編碼單鏈小分子，通過與靶信使RNA(mRNA)特異性的堿基互補(bǔ)配對(duì)，引起靶mRNA降解或者抑制其翻譯，從而對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)調(diào)控。miRNA在各個(gè)層面生命過程中起調(diào)節(jié)作用，涉及細(xì)胞發(fā)育、生長(zhǎng)、分化、凋亡，組織發(fā)育，關(guān)鍵蛋白的分泌等。近年來的研究顯示miRNA參與多種疾病的病理生理過程，如心血管疾病、腫瘤生成、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等，并發(fā)現(xiàn)miRNA與肺的生長(zhǎng)發(fā)育及肺部疾病的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸有著密切的關(guān)聯(lián)，如肺部腫瘤、肺纖維化、肺炎等

10、。國(guó)內(nèi)外對(duì)miRNA在ALI/ARDS發(fā)生發(fā)展中所起的作用研究的甚少，主要集中在感染、免疫、肺損傷等方面。
　　 生物芯片是一種具有高通量、高集成、微型化、連續(xù)化和自動(dòng)化特點(diǎn)的新技術(shù)。所謂生物芯片一般指高密度固定在互相支持介質(zhì)上的生物信息分子（如基因片段、DNA片段或多肽、蛋白質(zhì)、糖分子、組織等）的微陣列雜交型芯片，陣列中每個(gè)分子的序列及位置都是已知的，并且是預(yù)先設(shè)定好的序列點(diǎn)陣。miRNA芯片已熟練應(yīng)用于檢測(cè)和比較正常組織和疾

11、病組織中miRNA的表達(dá)譜，并且通過生物信息學(xué)分析其調(diào)控的靶基因可以深入分析其調(diào)控機(jī)制或生物學(xué)功能，對(duì)疾病診斷和新的治療有啟示性作用。過去研究中，雖然在基因及信號(hào)通路方面對(duì)ALI/ARDS發(fā)病機(jī)制及病理生理過程進(jìn)行了深刻的探索，但仍尚未完全明了。因此進(jìn)一步探尋ARDS發(fā)病機(jī)制及病理生理過程是亟待解決的醫(yī)學(xué)難題，具有重要的理論意義和臨床價(jià)值。
　　 基于以上理論，本研究擬采用通過氣管內(nèi)注入脂多糖的方法構(gòu)建小鼠ALI/ARDS的模型

12、，通過觀察小鼠一般情況、呼吸頻率，肺組織干濕重比、病理組織切片等方法評(píng)價(jià)模型成功與否;用生物芯片的方法分析ALI/ARDS小鼠肺組織的miRNA表達(dá)譜，篩選出差異表達(dá)的miRNA，用生物信息學(xué)方法對(duì)差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，并對(duì)其進(jìn)行深度分析，初步探討差異表達(dá)的miRNA及其靶基因?qū)LI/ARDS的調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步完善ARDS的發(fā)病機(jī)制及ARDS的治療提供新的思路。
　　 目的:
　　 1、通過氣管向肺內(nèi)滴

13、注脂多糖(LPS)，構(gòu)建小鼠ALI/ARDS模型。
　　 2、采用芯片技術(shù)研究LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI/ARDS肺組織中miRNA的表達(dá)譜，篩選出差異表達(dá)的miRNA，為進(jìn)一步探討miRNA在ALI/ARDS發(fā)生機(jī)制中的作用提供依據(jù)。
　　 3、用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)差異表達(dá)miRNA的靶基因，并對(duì)其進(jìn)行深度分析，找出與ALI/ARDS病理生理過程密切相關(guān)的miRNA及其靶基因。
　　 方法:
　　 C57B

14、L小鼠24只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組各12只。實(shí)驗(yàn)組小鼠通過氣管切開經(jīng)氣道向肺內(nèi)注入LPS(6mg·kg-1)，構(gòu)建小鼠ALI/ARDS模型。對(duì)照組用同樣的方法注入相應(yīng)劑量的生理鹽水，所有小鼠均于手術(shù)后24小時(shí)放血處死。術(shù)后觀察小鼠一般情況、呼吸頻率等，取左肺組織用于測(cè)量干濕重比，右中肺葉行HE染色觀察病理變化。應(yīng)用miRNA芯片技術(shù)檢測(cè)對(duì)照組及ALI/ARDS組小鼠肺組織miRNA表達(dá)譜的差異，選取其中差異較明顯的miRNA通過

15、查詢互聯(lián)網(wǎng)上miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件(TargetScan，miRanda，Clip-seq，miRDB)進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，并以三個(gè)或三個(gè)以上軟件共同預(yù)測(cè)結(jié)果作為microRNA的候選靶基因。將預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行Gene Ontology分析，并用Gather KEGG進(jìn)行相關(guān)信號(hào)通路分析。
　　 結(jié)果:
　　 1、和對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠精神萎靡，食欲差，被毛豎立，活動(dòng)差，嘴唇青紫，呼吸頻率明顯增快。其次，肺組織干濕重比明

16、顯增高。最后肺組織病理切片結(jié)果顯示部分肺泡間隔破壞，有明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，符合ALI/ARDS的病理改變。
　　 2、芯片結(jié)果顯示ALI/ARDS小鼠肺組織中明顯差異表達(dá)的miRNA有48個(gè)，其中上調(diào)的有27個(gè)，包括miR-574-5p，miR-483-5p，miR-711，miR-30c-1-3p，miR-92a-2-5p, miR-709, miR-466j, miR-690, miR-1902, miR-1897-5p,

17、miR-1940,miR-1894-3p, miR-3099-3p, miR-1249-5p, miR-149-3p, miR-193b-5p,miR-3087-5p,miR-3102-5p,miR-3473,miR-466m-5p,miR-504-3p,miR-5107,miR-5110，miR-5115，miR-5132，miR-669f-5p，miR-423-5p。下調(diào)的有21個(gè)。miR-98-5p, let-7a-5p, miR

18、-146b-5p, miR-200a-3p, miR-30b-5p, miR-145-5p,miR-130a-3p, miR-15a-5p, miR-467c-5p,miR-18a-3p,miR-133a-3p,miR-151-3p,miR-16-5p,miR-24-3p,miR-30d-5p,miR-34c-5p,miR-23a-3p,miR-3472,let-7g-5p, miR-3473b,miR-5128。
　　 3、應(yīng)

19、用靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)得到let-7a-5p，miR-16-5p，miR-24-3p，miR-146b-5p的靶基因分別有267，46，374和137個(gè)。應(yīng)用GO進(jìn)行靶基因富集、分類，分析查找與炎癥、肺發(fā)育、凋亡等相關(guān)的基因靶點(diǎn)，結(jié)果顯示，let-7a-5p靶基因中與炎癥相關(guān)的靶基因有48個(gè)，與凋亡相關(guān)的靶基因有16個(gè)，與肺發(fā)育相關(guān)的靶基因有6個(gè);miR-16-5p靶基因中與炎癥相關(guān)的靶基因有23個(gè)，與凋亡相關(guān)的靶基因有12個(gè)，與肺發(fā)育相

20、關(guān)的靶基因有4個(gè);miR-24-3p靶基因中與炎癥相關(guān)的靶基因有20個(gè)，與凋亡相關(guān)的靶基因有7個(gè)，與肺發(fā)育相關(guān)的靶基因有17個(gè)。對(duì)這些候選靶基因集進(jìn)行KEGG生物通路分析，從而找出最相關(guān)的生物通路上的靶基因。這些信號(hào)通路包括MAKP信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路等。
　　 結(jié)論:
　　 通過氣管經(jīng)氣道向肺內(nèi)注入LPS能成功構(gòu)建小鼠ALI/ARDS模型，miRNA在ALI/ARDS小鼠模型肺組織中發(fā)生