茶黃素衍生物作為候選殺微生物劑用于預(yù)防HIV性傳播的研究.pdf

1、研究背景：
　　 全球范圍內(nèi),艾滋病疫情日益嚴(yán)重。艾滋病病毒(Human immunodeficiencyvirus,HIV)經(jīng)性傳播是艾滋病流行的首要途徑。全球90％的感染者是通過性傳播而感染上HIV病毒的,其中女性感染者比例呈逐漸增加的趨勢(shì)。為降低HIV性傳播或性傳播疾病采取了很多預(yù)防措施,包括禁欲、一夫一妻制、常規(guī)使用安全套以及男性包皮環(huán)切術(shù)。但是對(duì)于HIV高致病地區(qū)的婦女,由于社會(huì)、經(jīng)濟(jì)和文化因素不能有效利用上述預(yù)防措施

2、。因此,開發(fā)有效的殺微生物劑來預(yù)防HIV的性接觸傳播是目前全球艾滋病預(yù)防的首要任務(wù)和重要課題。
　　 最近幾年有關(guān)HIV-1病毒和細(xì)胞膜融合導(dǎo)致病毒基因組進(jìn)入宿主細(xì)胞的分子過程已逐漸被闡明。在HIV的感染過程中,首先是HIV包被膜與靶細(xì)胞的細(xì)胞膜發(fā)生融合。HIV與靶細(xì)胞融合主要由包膜糖蛋白gp160(由包膜表面糖蛋白gp120和跨膜糖蛋白gp41非共價(jià)結(jié)合形成)介導(dǎo)。gp120與靶細(xì)胞上的CD4分子和輔助受體(趨化因子受體CCR

3、5或CXCR4等)依次結(jié)合,導(dǎo)致gp41的構(gòu)型發(fā)生改變,形成六股α-螺旋束核心結(jié)構(gòu),將病毒包膜與靶細(xì)胞膜拉近并發(fā)生融合,完成病毒進(jìn)入靶細(xì)胞的感染過程。這些對(duì)病毒進(jìn)入機(jī)制的研究使得干涉病毒進(jìn)入的治療和預(yù)防成為可能。
　　 天然產(chǎn)物由于具有來源廣泛、結(jié)構(gòu)多樣、有效和低毒等特點(diǎn),使天然來源HIV進(jìn)入抑制劑成為近年來研究和開發(fā)新型抗HIV-1藥物的熱點(diǎn)。茶黃素是紅茶中的主要成分,是一類具有苯駢卓酚酮結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。目前已發(fā)現(xiàn)并鑒定的茶黃素種

4、類共有28種,其中茶黃素(TF或TF1)、茶黃素-3-沒食子酸酯(TF-3-G或TF2A)、茶黃素-3’-沒食子酸酯(TF-3'-G或TF2B)和茶黃素-3,3’-雙沒食子酸酯(TFDG或TF3)是4種最主要的茶黃素。目前國(guó)內(nèi)外大量研究證實(shí)其具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗菌及抗增殖等作用,是一類極具開發(fā)潛力的天然產(chǎn)物。我們?cè)鴪?bào)道過紅茶中的茶黃素單體成分能特異性地作用于gp41,抑制gp41六螺旋核心結(jié)構(gòu)的形成。根據(jù)gv41晶體結(jié)構(gòu)

5、進(jìn)行的計(jì)算機(jī)輔助藥物模擬技術(shù)也表明TF3能結(jié)合到gv41的疏水性空穴中。
　　 盡管可以將上述茶黃素單體化合物作為殺微生物劑進(jìn)行開發(fā),但單體成分不穩(wěn)定,且難于分離純化。為此,我們制備了包含上述四種茶黃素單體(含量達(dá)到90％)的茶黃素衍生物,并證明其在酸性環(huán)境下(pH<6)性質(zhì)非常穩(wěn)定。健康女性的陰道環(huán)境維持在pH 4.0～5.0的酸性環(huán)境中,該環(huán)境有利于增強(qiáng)自然防御,因此茶黃素衍生物在酸性環(huán)境中穩(wěn)定的性質(zhì)更有利于將其開發(fā)為陰道用

6、殺微生物劑。由此可見,茶黃素衍生物若開發(fā)成陰道用殺微生物劑預(yù)防HIV的性傳播,將具有價(jià)廉、安全、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。
　　 目的：
　　 本文研究茶黃素衍生物(包括TF1、TF2A、TF2B、TF3四種茶黃素,四種成分總含量為90％)抗HIV的作用機(jī)制。同時(shí),將茶黃素衍生物(TF)制備為2％TF凝膠劑進(jìn)行研究,從細(xì)胞水平和動(dòng)物水平進(jìn)行TF凝膠劑的有效性及安全性評(píng)價(jià),為最終成功開發(fā)一種安全、有效、穩(wěn)定的抗HIV殺微生物劑候選分子奠

7、定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.由于茶黃素單體成分在中性或堿性環(huán)境中不穩(wěn)定,且分離純化的成本高。本研究以茶黃素衍生物(TF)為研究對(duì)象,用反相高效液相色譜法分析其所含成分。
　　 2.EIASA法檢測(cè)TF對(duì)HIV-1實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性病毒株和耐藥株的抑制活性,同時(shí)采用XTT法評(píng)價(jià)TF對(duì)人免疫細(xì)胞的毒性。
　　 3.采用時(shí)間過程實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞-細(xì)胞融合方法初步確定TF在病毒復(fù)制周期中的作用機(jī)制和藥物靶點(diǎn)。
　

8、　 4.用酶聯(lián)免疫測(cè)定法(ELISA)、天然聚丙烯酰胺凝膠電泳(N-PAGE)、分子排阻高效液相色譜法(SE-HPLC)檢測(cè)其抑制HIV gp41六螺旋束結(jié)構(gòu)形成的活性。檢測(cè)TF抑制HIV gp120與CD4結(jié)合的活性。同時(shí),檢測(cè)TF對(duì)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制活性。
　　 5.PAP251-286為衍生于精液中前列腺酸性磷酸酶(prostatic acidic phosphatase,PAP)的多肽,具有促進(jìn)HIV感染的活性,被稱

9、為精液來源的病毒增強(qiáng)肽(semen-derived enhancer of viral infection,SEVI)。用透射電子顯微鏡觀察PAP251-286形成的原纖維的顯微結(jié)構(gòu),研究TF對(duì)于SEVI形成的淀粉樣纖維的降解作用。
　　 6.比較TF在不同pH檸檬酸-磷酸緩沖溶液中的穩(wěn)定性。
　　 7.在單因素考察的基礎(chǔ)上,以規(guī)定時(shí)間的累積滲透量和TF凝膠劑粘度為指標(biāo),選取卡波姆濃度、氮酮、丙二醇的用量三個(gè)因素進(jìn)行正交

10、試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化最佳處方。對(duì)TF凝膠劑的穩(wěn)定性進(jìn)行了初步研究,包括耐熱實(shí)驗(yàn)、耐寒實(shí)驗(yàn)、離心實(shí)驗(yàn)。
　　 8.用XTT法檢測(cè)2％TF凝膠對(duì)人永生化陰道細(xì)胞(VK2/E6E7,Ect1/E6E7 andEnd1/E6E7)的毒性。通過皮膚過敏性實(shí)驗(yàn)以及家兔陰道粘膜刺激性實(shí)驗(yàn),對(duì)家兔陰道使用2％TF凝膠劑進(jìn)行初步安全性評(píng)價(jià)。采用PCNA免疫組化評(píng)價(jià)家兔陰道組織的炎癥。ELISA法檢測(cè)家兔陰道灌洗液中促炎細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6、IL

11、-8和TNF-α)和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子(IL-10和GM-CSF)的水平。
　　 9.采用HPLC法考察2％TF凝膠劑的體內(nèi)吸收。
　　 結(jié)果:
　　 1.TF主要含有茶黃素(TF或TF1)、茶黃素-3-沒食子酸酯(TF-3-G或TF2A)、茶黃素-3’-沒食子酸酯(TF-3-G或TF2B)和茶黃素-3,3’-雙沒食子酸酯(TFDG或TF3)4種茶黃素。四種茶黃素的總含量為90％。
　　 2.TF能高效抑制

12、多種HIV-1實(shí)驗(yàn)室病毒株包括HIV-1X4型和R5型病毒,而且對(duì)耐藥株感染也有顯著的抑制活性。表明TF具有極為廣譜的抗病毒活性。通過細(xì)胞毒性試驗(yàn)證明TF對(duì)人免疫細(xì)胞無毒性。
　　 3.時(shí)間過程實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TF在病毒感染后2小時(shí)加入時(shí),對(duì)病毒已無明顯抑制活性,在病毒感后1小時(shí)之內(nèi)加入時(shí),才顯示很強(qiáng)的抑制活性,表明TF作用于病毒生活周期的早期。加入TF后H9/HIV-1ⅢB和MT2細(xì)胞混合培
　　 養(yǎng)后融合形成大量合胞體數(shù)

13、目明顯減少,其抑制率隨著劑量的加大而增加,IC50為1.788μg/ml,表明TF有效抑制HIV包膜介導(dǎo)的細(xì)胞融合。通過這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)我們可以推測(cè)TF通過抑制HIV包膜介導(dǎo)的細(xì)胞融合從而阻止HIV的進(jìn)入。
　　 4.N36和C34是從HIV gp41的NHR和CHR區(qū)衍生出來的多肽,二者在體外能形成類似gp41 NHR和CHR結(jié)合的螺旋結(jié)構(gòu)。因此,抗gp41六螺旋束核心結(jié)構(gòu)的活性可以用抑制N36和C34結(jié)合的作用來測(cè)定。
　　

14、 5.人精液中的多肽PAP251-286,即SEVI,能形成淀粉樣原纖維,促進(jìn)HIV感染。因此,SEVI被認(rèn)為是促進(jìn)HIV性傳播的主要因素。電鏡下觀察到PAP251-286在濃度為8 mg/ml能形成大量典型的淀粉樣原纖維的結(jié)構(gòu)并且能穩(wěn)定存在36小時(shí)。TF在2 mg/ml時(shí)能形成細(xì)小聚集物。TF與PAP251-286形成的原纖維37℃共同孵育36小時(shí)后,纖維結(jié)構(gòu)明顯破壞分解。表明TF能夠破壞SEVI淀粉樣原纖維的結(jié)構(gòu),從而阻止精液導(dǎo)致

15、的HIV感染。
　　 6.當(dāng)TF在pH 3～6的環(huán)境中,24小時(shí)內(nèi)HPLC色譜峰沒有明顯的改變。相反,當(dāng)TF在pH為7～9的環(huán)境中4小時(shí)后含量減少,且大部分TF在24小時(shí)后完全降解。表明TF在pH酸性環(huán)境中穩(wěn)定。
　　 7.處方含有2％TF最適合臨床前和臨床研究。4％TF凝膠由于含有高濃度的有效成分使其長(zhǎng)時(shí)間不能被吸收。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化的最佳處方為卡波姆974P濃度為1％,甘油濃度為0.75％,丙二醇濃度為15％(w/w

16、)。所制凝膠pH為4.1～4.7。TF凝膠劑經(jīng)體外釋放過程符合Higuchi方程。TF凝膠劑在室溫條件下穩(wěn)定性良好。
　　 8.TF對(duì)3種人正常陰道及子宮頸組織上皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用均很低,且選擇指數(shù)超過100。TF凝膠未見皮膚過敏性。
　　 9.2％TF凝膠單次陰道給藥后不會(huì)產(chǎn)生系統(tǒng)吸收。然而,在給藥1小時(shí)后的陰道灌洗液中檢測(cè)到較高濃度的茶黃素。更為重要的是,即使是給藥6小時(shí)以后,仍然有TF殘留,表明TF可以作為每天只

17、用1次的殺微生物劑進(jìn)行研發(fā)。
　　 結(jié)論:
　　 通過對(duì)TF體外藥效學(xué)研究,發(fā)現(xiàn)茶黃素衍生物(TF)具有廣譜的抗HIV活性。TF可通過多種機(jī)制抑制HIV的復(fù)制,為多靶點(diǎn)的HIV進(jìn)入抑制劑,包括抑制HIV gp41六股螺旋束結(jié)構(gòu)的形成,阻止gp120與CD4的結(jié)合。在高濃度時(shí),TF還能抑制HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的活性。尤其值得注意的是,表明TF能夠破壞SEVI形成的淀粉樣原纖維,從而阻止精液導(dǎo)致的HIV感染。由此可見,TF抑制HI

18、V的作用機(jī)理明確、來源廣泛、價(jià)廉,若將其作為第二代殺微生物劑用于預(yù)防HIV的性傳播,有顯著的優(yōu)越性和可行性。
　　 本研究進(jìn)一步將TF制備為陰道用凝膠劑,確定最佳處方為TF為2％,卡波姆974P濃度為1％,甘油濃度為0.75％,丙二醇濃度為15％(w/w)。作為理想的殺微生物劑,另一個(gè)必要條件是對(duì)人體安全無毒。體外安全性實(shí)驗(yàn)表明2％TF凝膠劑無毒性和刺激性,不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞炎癥或者陰道上皮細(xì)胞的超常增生,并且不能吸收入血產(chǎn)生系統(tǒng)副作