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1、生物催化和轉(zhuǎn)化技術(shù)因其高效性、多樣性、底物專一性、區(qū)域選擇性、化學(xué)選擇性、對(duì)映選擇性以及溫和的反應(yīng)條件等特點(diǎn),被譽(yù)為繼醫(yī)藥生物技術(shù)和農(nóng)業(yè)生物技術(shù)之后的“第三次生物技術(shù)浪潮”。本文采用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)進(jìn)行新農(nóng)藥的創(chuàng)制。選擇了高效,對(duì)溫血?jiǎng)游锏投镜臒焿A類殺蟲(chóng)劑吡蟲(chóng)啉(imidaeloprid,IMI)為底物,從自然界和菌種庫(kù)中篩選可轉(zhuǎn)化IMI的菌株,采用靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化法羥基化IMI,獲得了一種IMI羥基化的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物5-羥基吡蟲(chóng)啉(5-hydro
2、xy IMI),5-hydroxy IMI經(jīng)酸、熱水解可得到文獻(xiàn)報(bào)道的殺蟲(chóng)活性提高10-16倍的烯式毗蟲(chóng)啉(olefin IMI)。 以IMI為唯一氮源進(jìn)行富集培養(yǎng),從土壤中篩選到了7株可將IMI轉(zhuǎn)化為一種極性更大的化合物的菌株。其中一株命名為NJl的菌株具有較高的轉(zhuǎn)化IMI的能力,轉(zhuǎn)化樣品經(jīng)HPLC/MS分析,證明該極性更大的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為IMI的羥基化衍生物。采用BioMerieux Vitek自動(dòng)微生物分析儀鑒定,NJl菌株
3、被鑒定為Stenotrophomonasmaltophilia;16S rDNA結(jié)果分析進(jìn)一步證明了NJl菌株與在系統(tǒng)發(fā)育地位上屬于S. maltophilia。從菌種庫(kù)中篩選結(jié)果表明,與NJl菌株屬于同一個(gè)種的S.maltophiliaCGMCC 1.1788菌株的轉(zhuǎn)化能力高于NJl菌株。S.maltophilia CGMCCl.1788被選為進(jìn)一步研究用菌種。 S.maltophilia CGMCC 1.1788菌株發(fā)酵條
4、件研究結(jié)果表明,培養(yǎng)溫度介于20至35℃之間,羥基化酶活性幾乎沒(méi)有變化,而最適生長(zhǎng)溫度為30℃;最高羥基化酶活性出現(xiàn)在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期之后;蘋(píng)果酸和麥芽糖為最適生長(zhǎng)碳源,琥珀酸和乙酸鈉為羥基化酶活性碳源,乙酸鈉為最適比酶活力碳源;牛肉膏為最適生長(zhǎng)氮源,酵母膏和玉米漿分別為最適羥基化酶活性和比酶活力氮源;各種吡啶類化合物和咪唑烷類化合物作為誘導(dǎo)劑添加到培養(yǎng)基中,測(cè)試結(jié)果表明酶形成不需要誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)。 5.hydroxy IMI合成條
5、件研究結(jié)果表明,酶活性受通氣量影響較大,搖瓶裝液量越少,酶活性越大,搖瓶轉(zhuǎn)速越高,轉(zhuǎn)化活力越高;最適轉(zhuǎn)化溫度為25℃;在轉(zhuǎn)化液中添加蔗糖、葡萄糖和蘋(píng)果酸等促進(jìn)劑可顯著提高酶活性,添加5%(w/v)蔗糖的轉(zhuǎn)活性較對(duì)照組提高了近9倍;最適羥基化酶活性pH為6.5;底物最適濃度為0.01%。 采用5L發(fā)酵罐進(jìn)行S.maltophilia CGMCC 1.1788的發(fā)酵和轉(zhuǎn)化研究,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,轉(zhuǎn)化70h后,轉(zhuǎn)化液中轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的含量可達(dá)
6、到260rag/L轉(zhuǎn)化液。采用二氯甲烷萃取兩次后,約97%的未轉(zhuǎn)化的底物被去除,93%的產(chǎn)物仍保留在水相中;含有轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的水相部分再用等體積的乙酸乙酯萃取,87%的產(chǎn)物可被萃取到乙酸乙酯相中。萃取液經(jīng)濃縮,有機(jī)相膜過(guò)濾,結(jié)晶后,可得到純度為98%的產(chǎn)物晶體。晶體經(jīng)質(zhì)譜、元素分析、核磁共振光譜和單晶體x一射線衍射法分析,確認(rèn)其結(jié)構(gòu)為5.hydroxy IMI,且羥基所在的碳原子具有順式構(gòu)。 采用酸熱水解法將5-hydroxy I
7、MI轉(zhuǎn)變成olefin IMI實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,0.1M鹽酸、80℃加熱25 min后,5-hydroxy IMI可完全被水解;酸熱水解產(chǎn)物經(jīng)HPLC/MS和NMR分析確認(rèn)為olefin IMI。5-hydroxy IMI轉(zhuǎn)變?yōu)閛lefin IMI的摩爾轉(zhuǎn)變系數(shù)為86.97%。生物活性測(cè)試結(jié)果表明,olefin IMI和5-hydroxy IMI均有殺蠶豆蚜活性。經(jīng)以IMI為對(duì)照,三者的殺蟲(chóng)活性排序?yàn)閛lefin IMI>IMI>5-hyd
8、roxy IMI。相對(duì)毒力指數(shù)測(cè)定表明,olefin IMI對(duì)蠶豆蚜成蟲(chóng)的活性是IMI的19倍,是蠶豆蚜若蚜的2.25倍,olefin IMI對(duì)褐飛虱成蟲(chóng)的活性是IMI的1.43倍,但對(duì)褐飛虱若蟲(chóng)的活性只有IMI的0.5倍。盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證了室內(nèi)生物活性結(jié)果,并證明olefin IMI對(duì)蠶豆苗安全。 綜上所述,本論文采用微生物轉(zhuǎn)化法獲得了5-hydroxy IMI,5-hydroxy IMI經(jīng)酸水解后得到了對(duì)蚜蟲(chóng)成蟲(chóng)生物活性高于I
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