殼聚糖的微生物發(fā)酵制備、硫酸酯化修飾及其衍生物類(lèi)肝素活性的研究.pdf

1、本文首先對(duì)用微生物發(fā)酵制備殼聚糖的方法進(jìn)行了研究。對(duì)魯氏毛霉發(fā)酵制備殼聚糖的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。確定了合理的碳源、氮源、無(wú)機(jī)離子的濃度，以及pH值等條件。進(jìn)一步的正交試驗(yàn)表明：在溫度28℃，100mL/500mL的裝樣量，轉(zhuǎn)速180rpm的培養(yǎng)條件下，發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖5.0％，蛋白胨2.0％，KH2PO40.4％，酵母浸膏0.2％，MgSO40.1％，pH4.5時(shí)，獲得的魯氏毛霉的菌絲體生物量最大。對(duì)其生長(zhǎng)曲線的研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵時(shí)間為36

2、h時(shí)菌絲體收率最高，干重可達(dá)1.325g/100ml,殼聚糖產(chǎn)率為9.6％，殼聚糖含量為1.272g/L。產(chǎn)品的粘均分子量為1.64×105，脫乙酰度為86.02％，純度為83.5％。紅外光譜分析表明與從蝦殼中提取的殼聚糖的結(jié)構(gòu)基本上一致。 下一步實(shí)驗(yàn)，本文微生物發(fā)酵提取的殼聚糖進(jìn)行了硫酸酯化修飾，采用氯磺酸/甲酰胺作為硫酸酯化試劑。以硫含量為指標(biāo)，考察了反應(yīng)時(shí)間及溫度對(duì)殼聚糖硫酸酯化反應(yīng)的影響，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)得出了硫含量與反應(yīng)時(shí)

3、間、溫度之間的關(guān)系，確定了最佳的修飾條件并初步探究了硫酸酯化反應(yīng)的機(jī)理。固定試劑用量1g殼聚糖，2.5ml氯磺酸，10ml甲酰胺，水浴70℃，反應(yīng)時(shí)間為3.5小時(shí)的條件下殼聚糖衍生物的硫含量最高，達(dá)16.48％。紅外光譜及13C-NMR分析表明殼聚糖主鏈糖環(huán)的C6位已確定地取代上了硫酸基，硫酸酯化反應(yīng)按親電反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行，SO3為親電試劑。衍生物的粘均分子量為5-6萬(wàn)，水溶性良好。 最后本文對(duì)制備的一系列殼聚糖硫酸酯化衍生物的抗凝

4、血及抗血栓活性進(jìn)行了分析比較。此類(lèi)衍生物均和肝素一樣能使甲苯胺藍(lán)發(fā)生變色反應(yīng)，也就是說(shuō)具有類(lèi)肝素結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)具有和肝素類(lèi)似的抗凝血效果。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，分別采用體外測(cè)定全血復(fù)鈣時(shí)間和纖維蛋白平板法兩種方法對(duì)衍生物的抗凝血、抗血栓性能進(jìn)行了綜合評(píng)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，自制的殼聚糖O-6硫酸酯化衍生物具有類(lèi)肝素物質(zhì)的性質(zhì)，具有抗凝血和抗血栓形成的良好性能。在一定范圍內(nèi)(S％≤13.93％)，殼聚糖硫酸酯的硫含量的高低可以反映出其抗凝血、抗血栓性能的大