妊娠糖尿病致胚胎神經(jīng)管畸形及其機理的實驗研究.pdf

1、流行病學(xué)調(diào)查和動物實驗都證明，妊娠糖尿病或孕期持續(xù)性高血糖可引起胚胎發(fā)育畸形，神經(jīng)管畸形的發(fā)生率最高，但對其發(fā)生機理的研究報道甚少，因而對于妊娠糖尿病致胚胎神經(jīng)管畸形的發(fā)生機理至今尚不很清楚，由發(fā)生機理為基礎(chǔ)的預(yù)防和治療方面的研究也受到了極大限制。本文在國家自然科學(xué)基金和山東省自然科學(xué)基金的支持下，對妊娠糖尿病引起胚胎神經(jīng)管畸形的發(fā)生機理進(jìn)行了比較深入的研究。實驗分為三個部分進(jìn)行： 第一部分：妊娠糖尿病致胚胎神經(jīng)管畸形的動物模型

2、的建立 以小鼠為實驗動物，用腹腔注射鏈脲霉素的方法將雌性小鼠制成糖尿病鼠。將雌性糖尿病小鼠與雄性健康小鼠合籠交配，孕11.5天時剖腹取胎，解剖顯微鏡下檢查胚胎神經(jīng)管畸形的外部表征；經(jīng)固定、切片、染色后，光鏡下檢查神經(jīng)管畸形的內(nèi)部表征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖尿病孕鼠的胚胎中有16％左右神經(jīng)管未閉合并出現(xiàn)神經(jīng)管畸形的外部表征，而正常孕鼠同齡胚胎的神經(jīng)管幾乎全部閉合。 第二部分：妊娠糖尿病致胚胎神經(jīng)管畸形發(fā)生機理的在體實驗 在成

3、功建立了妊娠糖尿病致胚胎神經(jīng)管畸形動物模型的基礎(chǔ)上，本部分進(jìn)行了發(fā)生機理的在體實驗。神經(jīng)管是中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦和脊髓的原基，神經(jīng)組織來自神經(jīng)管壁上的神經(jīng)上皮，神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞由神經(jīng)上皮細(xì)胞即神經(jīng)上皮干細(xì)胞增殖分化而來。在腦和脊髓的發(fā)育過程中，既有神經(jīng)上皮干細(xì)胞的有序增殖，也有神經(jīng)上皮干細(xì)胞的有序凋亡，這種有序的細(xì)胞增殖和凋亡不僅受著特定基因時空有序表達(dá)的調(diào)控，也受著環(huán)境因素的影響。神經(jīng)管發(fā)育相關(guān)基因的突變或表達(dá)異常，環(huán)境有害因素的出現(xiàn)

4、，都會引起神經(jīng)上皮干細(xì)胞增殖和凋亡過程的異常變化，從而導(dǎo)致神經(jīng)管畸形的發(fā)生。本實驗應(yīng)用原位末端標(biāo)記、BrdU標(biāo)記、DAPI染色等技術(shù)方法，檢測了糖尿病孕鼠胚胎神經(jīng)管神經(jīng)上皮干細(xì)胞的增殖和凋亡狀況。實驗結(jié)果顯示：糖尿病孕鼠胚胎神經(jīng)管神經(jīng)上皮干細(xì)胞的增殖數(shù)目明顯低于正常對照組，差異十分顯著(P＜0.01)；細(xì)胞凋亡數(shù)明顯高于正常對照組，差異十分顯著(P＜0.01)。 第三部分：妊娠糖尿病致胚胎神經(jīng)管畸形發(fā)生機理的體外實驗 本

5、課題第二部分的在體實驗的結(jié)果顯示，神經(jīng)上皮干細(xì)胞的過度凋亡和增殖受阻是糖尿病致胚胎神經(jīng)管畸形的重要機制。但是，胚胎神經(jīng)管的神經(jīng)上皮干細(xì)胞的增殖和凋亡過程受到胚胎和母體內(nèi)多種因素的影響，高血糖只是其中一個影響因素。為了排除高血糖之外其它因素可能的影響，我們進(jìn)行了體外實驗，利用體外培養(yǎng)神經(jīng)上皮干細(xì)胞的方法，檢測高濃度糖這一單一因素對細(xì)胞增殖和分化的影響。具體做法是：將神經(jīng)干細(xì)胞分別培養(yǎng)于生理糖培養(yǎng)基和高糖培養(yǎng)基中，為排除高糖培養(yǎng)基所引起的滲

6、透壓變化的影響，還設(shè)立了與高糖培養(yǎng)基等滲但有效葡萄糖濃度仍為生理糖濃度的對照組。應(yīng)用BraU標(biāo)記方法測定了培養(yǎng)細(xì)胞的增殖情況，用MTT法檢測了培養(yǎng)細(xì)胞的代謝和增殖活性，用原位末端標(biāo)記(TUNEL)方法檢測了培養(yǎng)細(xì)胞的凋亡情況，用Westernblot技術(shù)檢測了凋亡相關(guān)基因Caspase-3的活化情況。實驗結(jié)果顯示：高糖培養(yǎng)下的神經(jīng)干細(xì)胞，與生理糖濃度培養(yǎng)下的神經(jīng)干細(xì)胞相比：①其BrdU陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異十分顯著(P＜0.01)，且

7、排除了滲透壓影響的可能性，表明高濃度糖可抑制神經(jīng)干細(xì)胞的增殖；②MTT檢測的OD值明顯降低，差異十分顯著(P＜0.05)，且排除了滲透壓影響的可能性，表明高濃度糖可降低神經(jīng)干細(xì)胞的代謝和增殖活性；③原位末端標(biāo)記檢測的細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增多，差異十分明顯(P＜0.01)，且排除了滲透壓影響的可能性，表明高濃度糖可導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞過度凋亡；④Westernblot檢測到活化的Caspase-3的表達(dá)量明顯增多，并與作用時間成正相關(guān)，表明高濃度糖引