妊娠糖尿病致胚胎神經(jīng)前體細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究.pdf

1、山東大學(xué)博士學(xué)位論文妊娠糖尿病致胚胎神經(jīng)前體細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究姓名：劉尚明申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：人體解剖與組織胚胎學(xué)指導(dǎo)教師：郝愛(ài)軍20110331山東大學(xué)博上學(xué)位論文我們前期研究發(fā)現(xiàn)，非受體酪氨酸激酶c—Abl在高糖誘導(dǎo)的NPCs凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用。高糖誘導(dǎo)NPCs凋亡過(guò)程中，cAbl尤其是核中的cAbl表達(dá)上調(diào)。多項(xiàng)研究表明，DNA損傷及氧化應(yīng)激時(shí)，cAbl通過(guò)其SH3結(jié)構(gòu)域與PKC5結(jié)合并將PKC6上的酪氨酸殘基磷酸化。因

2、此，在PKC8激活導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡中，cAbl可能是一種關(guān)鍵的輔助因子。同時(shí)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，p53介導(dǎo)的凋亡在NTDs的發(fā)生中起重要作用。在野生型的小鼠胚胎中，抑帶1Jp53能引起神經(jīng)管上皮細(xì)胞凋亡減少，在p53基因敲除(p53／)胚胎中，不能檢測(cè)到神經(jīng)上皮細(xì)胞的凋亡。此外，大量研究發(fā)現(xiàn)DNA損傷后能同時(shí)激活p53和CAbl。以上研究資料提示，p53可能是高糖誘導(dǎo)NPCs凋亡過(guò)程中，PKC8cAbl通路上的關(guān)鍵因子。在本研究中，我們

3、首先建立了高糖誘導(dǎo)NPCs凋亡模型，并從在體及體外兩方面對(duì)高糖誘導(dǎo)NPCs凋亡時(shí)PKC5的作用及作用機(jī)制進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：cAbl可以結(jié)合并磷酸化PKC8酪氨酸殘基；隨后，PKC6cAbl復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核，從而引起核qbp53的聚集，進(jìn)而引起NPCs凋亡。一、高糖誘導(dǎo)NPCs凋亡模型的建立及凋亡的檢測(cè)1體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：選用8周雌性Swiss小鼠，連續(xù)3天腹腔注射鏈脲霉素(streptozotocin，STZ，75mg／kg)，7天后檢測(cè)小

4、鼠血糖水平，血糖值高于167mmoYl(300mg／d1)為糖尿病小鼠。將雌性糖尿病小鼠與健康雄性小鼠合籠交配，次日查到陰栓定為受精后胚胎05天(E05)，孕115天(E115)時(shí)剖腹取胎，解剖顯微鏡下檢查胚胎發(fā)育情況，部分小鼠出現(xiàn)明顯的顱腦神經(jīng)管未閉合現(xiàn)象。E115天胚腦切片TUNEL染色顯示：GDM小鼠胚胎腹側(cè)端腦(ventraltelencephalonzone，VZ)部位神經(jīng)上皮細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯高于正常對(duì)照組。2體外實(shí)驗(yàn)：于小鼠

5、妊娠后115天應(yīng)用體視顯微鏡成功分離胚胎神經(jīng)管前端腦泡，經(jīng)機(jī)械吹打后，獲得細(xì)胞懸液，接種于無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)基，獲得神經(jīng)球。取第二代神經(jīng)球，經(jīng)胰酶消化后接種于多聚賴氨酸處理的培養(yǎng)皿中，獲取單層NPCs。為檢測(cè)高濃度葡萄糖對(duì)體外培養(yǎng)NPCs的作用，實(shí)驗(yàn)組用含35mM葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)，對(duì)照組用含5mM葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)。為了進(jìn)一步排除滲透壓因素可能造成的細(xì)胞凋亡，甘露醇組用含有5mM葡萄糖及30mM甘露醇的培養(yǎng)基。24h及48h后，DAPI