孕期神經(jīng)管缺陷畸形蛋白質(zhì)譜的初步篩查研究.pdf

1、神經(jīng)管缺陷(neural tube defects,NTDs)是常見的先天性中樞神經(jīng)系統(tǒng)畸形。其發(fā)生機(jī)制是在胚胎生長(zhǎng)發(fā)育的前四周內(nèi)神經(jīng)管閉合發(fā)生障礙,導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的各種畸形。包括無(wú)腦兒,脊柱裂,腦膜膨出,脊髓脊膜膨出,腦膨出,腦積水,脊髓積水空洞癥等。神經(jīng)管缺陷的發(fā)病率為,女性高于男性,農(nóng)村高于城市,北方高于南方。我國(guó)神經(jīng)管缺陷發(fā)生率約為10.63/萬(wàn)。神經(jīng)管缺陷胎兒約54％在孕27周前自然流產(chǎn),46％進(jìn)入圍產(chǎn)期。缺陷兒童的出生,不僅造

2、成家庭與社會(huì)的沉重負(fù)擔(dān),而且嚴(yán)重影響人口素質(zhì)。因此,除對(duì)致病因素預(yù)防外,產(chǎn)前診斷是目前極為重要而且有效的方法。目前神經(jīng)管缺陷的產(chǎn)前篩查主要依靠超聲影像學(xué)和孕母血清和羊水蛋白質(zhì)標(biāo)記物的檢測(cè)。
　　 產(chǎn)前超聲檢查已成為當(dāng)前最常用的診斷胎兒形態(tài)異常的金標(biāo)準(zhǔn)。但做超聲檢查,胎齡必須達(dá)12周以上,并且對(duì)于腰骶部位病變、胎兒體位不理想、胎動(dòng)活躍,孕婦肥胖等均容易漏診。孕母血清甲胎蛋白和羊水甲胎蛋白檢測(cè)是產(chǎn)前診斷的重要內(nèi)容。孕母血清甲胎蛋白(

3、maternal serum alpha-fetoprotein,MSAFP)和羊水甲胎蛋白(amniotic fluid alpha-fetoprotein,AFAFP)含量增高可以提示胎兒神經(jīng)管缺陷。但多胎妊娠、胎兒腹壁缺損、先天性腎病、胎死宮內(nèi)、胎兒血污染羊水等因素均可引起甲胎蛋白假陽(yáng)性增高。而且羊膜腔穿刺取羊水、早孕絨毛組織檢查和植入性產(chǎn)前遺傳診斷均為侵入性診斷,可造成孕婦和胎兒的損傷、陰道出血、感染和流產(chǎn),故其應(yīng)用受到限制。<

4、br>　　 蛋白質(zhì)是細(xì)胞代謝和調(diào)控途徑的主要執(zhí)行者,蛋白質(zhì)組學(xué)是研究細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)的組成和變化的新學(xué)科,它對(duì)于疾病的早期診斷和發(fā)病機(jī)制都具有重要意義。研究不同時(shí)期細(xì)胞蛋白質(zhì)組成的變化,發(fā)現(xiàn)有差異表達(dá)的蛋白質(zhì)即“表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)”是現(xiàn)今應(yīng)用最為廣泛的蛋白質(zhì)組學(xué)研究模式。在質(zhì)譜分析基礎(chǔ)上發(fā)展的表面增強(qiáng)激光解吸/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(surface enhanCed laser desorption/ionization time-of-

5、flight mass spectrometry,SELDI-TOF-MS)對(duì)某些疾病,特別是腫瘤、遺傳性疾病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的相關(guān)蛋白的識(shí)別上已經(jīng)取得了突破性進(jìn)展。探索神經(jīng)管缺陷特異性標(biāo)志蛋白,建立一套簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高和特異性強(qiáng)的早期診斷技術(shù)已成為臨床醫(yī)學(xué)的迫切需要。本實(shí)驗(yàn)中我們采用SEIDI技術(shù),選取蛋白質(zhì)芯片中的弱陽(yáng)離子芯片改進(jìn)型CM10芯片,篩選胎兒神經(jīng)管缺陷的孕母血清、尿液、羊水和神經(jīng)管缺陷胎鼠羊水蛋白質(zhì)標(biāo)志物,為提高神

6、經(jīng)管缺陷診斷效率奠定基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)中所有臨床標(biāo)本均經(jīng)過(guò)孕婦本人書面同意,并經(jīng)過(guò)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。
　　 材料與方法：
　　 一、實(shí)驗(yàn)對(duì)象
　　 (一)胎兒神經(jīng)管缺陷的孕母血清標(biāo)本
　　 經(jīng)超聲確診為胎兒神經(jīng)管缺陷的孕婦17例,孕周數(shù)相匹配的正常孕婦14例。神經(jīng)管缺陷包括脊柱裂7例,無(wú)腦兒4例,腦積水6例。對(duì)照組孕婦為同期接受產(chǎn)前檢查的受檢者。所有孕婦均于清晨空腹取外周靜脈血5m

7、l,立即置于4℃,靜置1～2h。再于4℃,4000 rpm,離心10min。吸取上清,按每管100μl分裝,置于-80℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 (二)胎兒神經(jīng)管缺陷的孕母尿液標(biāo)本
　　 經(jīng)超聲確診為神經(jīng)管缺陷的孕婦20例,孕周數(shù)相匹配的正常孕婦15例。神經(jīng)管缺陷包括脊柱裂10例,無(wú)腦兒5例,腦積水5例。對(duì)照組孕婦為同期接受產(chǎn)前檢查的受檢者。所有孕婦均取清晨空腹尿5ml,立即于4℃,2500rpm,離心min。吸取上清,按每管1

8、00μl分裝,置于-80℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 (三)胎兒神經(jīng)管缺陷的孕母羊水標(biāo)本
　　 經(jīng)超聲確診為神經(jīng)管缺陷的孕婦11例,孕周數(shù)相匹配的正常孕婦9例。神經(jīng)管缺陷包括脊柱裂5例,無(wú)腦兒5例,腦積水1例。對(duì)照組孕婦為同期接受產(chǎn)前檢查的受檢者。所有孕母均于引產(chǎn)前經(jīng)腹抽取羊水5ml,立即于4℃,2500 rpm,離心5min。吸取上清,按每管100山分裝,置于-80℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 (四)神經(jīng)管缺陷胎鼠羊水標(biāo)本

9、　　 26只雌性Wistar大鼠(體重220～260g),分為畸形組(n=11)和對(duì)照組(n=15)。在標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng),午夜雌:雄=4:1合籠。次日清晨8時(shí)陰道涂片,鏡檢精子,確定其妊娠日期,有精子者計(jì)為孕0日(E0)。在孕10日(E10)晨8時(shí),畸形組雌鼠稱體重,按120mg/Kg稱取全反式維甲酸與礦物油混合均勻(維甲酸濃度為40mg/ml),經(jīng)胃管一次注入孕鼠胃內(nèi)。對(duì)照組僅將不含維甲酸的礦物油與畸形組同量經(jīng)胃管一次注入。雌鼠于孕1

10、7天(E17),用10％水合氯醛按300mg/Kg進(jìn)行腹腔注射麻醉。將孕鼠固定于操作臺(tái)上,酒精消毒腹部,剪開腹部皮膚及肌肉,暴露子宮。在子宮外大體確定是否存在畸形。用2ml無(wú)菌注射器抽取胎鼠羊膜腔內(nèi)羊水,每只胎鼠取出約0.1～0.3ml羊水,每只胎鼠羊水單獨(dú)分裝。選取羊水清亮者立即置于4℃保存。在立體顯微鏡下進(jìn)一步確認(rèn)胎鼠有無(wú)畸形和畸形類型?；谓M中胎鼠畸形分四種:①單純性肛門閉鎖畸形；②脊柱裂合并肛門閉鎖畸形；③脊柱裂合并肛門閉鎖和馬

11、蹄內(nèi)翻足畸形；④給藥后無(wú)畸形。選取脊柱裂合并肛門閉鎖畸形組的胎鼠羊水作為研究對(duì)象。對(duì)照組胎鼠均為正常胎鼠。所有羊水立即于4℃,4000 rpm,離心10min。吸取上清,按每管100μl分裝,置于-80℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 二、蛋白質(zhì)芯片類型
　　 選用SELDI蛋白質(zhì)芯片中CM10芯片,CM10芯片是弱陽(yáng)離子親和芯片WCX2芯片的改進(jìn)型。具有變異系數(shù)小,重復(fù)性好,操作方便,結(jié)果更穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。購(gòu)于美國(guó)Ciphergen公司

12、。
　　 三、主要試劑
　　 TFA:三氟乙酸；NaAC:醋酸鈉；DTT:二硫蘇糖醇；CHAPS:3-[3-(膽酰胺基丙基)二甲氨基]丙磺酸鹽；Urea:尿素；ACN:乙腈； SPA:飽和芥子酸。均為Sigma原裝進(jìn)口,購(gòu)自SIGMA公司北京代理:北京舒伯偉化工儀器有限責(zé)任公司。
　　 四、孕母血清(尿,羊水)和胎鼠羊水樣品處理
　　 于-80℃中取出孕母血清(尿,羊水)和胎鼠羊水樣品,4℃融解。10,0

13、00rpm,4℃,離心2min。取10μl血清(尿,羊水)和胎鼠羊水樣品用20μl U9緩沖液稀釋,混勻,置于4℃變性。加入360μl(尿加250μl,孕母羊水和胎鼠羊水均加170μl)緩沖液,混勻,使血清(尿,孕母羊水和胎鼠羊水)總稀釋倍數(shù)達(dá)到約39倍(尿?yàn)?8倍,羊水為20倍)。上樣和洗脫:在CM10芯片上每孔加入200μl結(jié)合緩沖液,震蕩5min,甩掉緩沖液。重復(fù)上述操作一次。加入處理好的樣品100μl,室溫震蕩60min,甩出樣

14、品。再次加入結(jié)合緩沖液200μl,室溫震蕩5min,甩去孔中液體。重復(fù)操作一次。加入超純水200μl,立刻甩出。取出芯片,待自然風(fēng)干后,加能量吸收分子飽和芥子酸SPA0.5 μl二次。待干后,即可上機(jī)測(cè)定。
　　 五、數(shù)據(jù)采集與分析
　　 采用PBSIIC型蛋白質(zhì)芯片閱讀機(jī)讀取數(shù)據(jù)。設(shè)定優(yōu)化相對(duì)分子質(zhì)量范圍1000～30,000Da。每次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)收集前,用All-in-one蛋白質(zhì)芯片校正儀器,使蛋白質(zhì)分子量誤差<0.1

15、％。應(yīng)用Biomarker Wizard(美國(guó)Ciphergen公司)軟件分析處理所有峰譜,形成蛋白質(zhì)指紋圖譜。所有的圖譜都進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,定義蛋白峰信噪比(S/N)>5,變異系數(shù)CV<10％。采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)比較配對(duì)樣本的蛋白峰,計(jì)算P值。P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Ciplaergen protein chip 3.1.1軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)論：
　　 1、應(yīng)用表面增強(qiáng)激光解吸/離子化

16、飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)篩查出胎兒神經(jīng)管缺陷的孕母血清、尿液和羊水的差異蛋白峰,這些差異蛋白峰可能是胎兒神經(jīng)管缺陷孕母血清、尿液和羊水的特異性蛋白質(zhì)標(biāo)志物。
　　 2、應(yīng)用胎兒神經(jīng)管缺陷的孕母血清和尿液蛋白質(zhì)標(biāo)記物建立決策分類樹診斷模型,對(duì)于神經(jīng)管缺陷的診斷靈敏度分別為88.2％、80.0％,特異度分別為100％、93.3％。證明表面增強(qiáng)激光解吸/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)對(duì)于診斷神經(jīng)管缺陷是一項(xiàng)有效、快捷、靈敏度高、特異性強(qiáng)的臨床診斷工具