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文檔簡介
1、研究背景:
神經(jīng)管畸形(NTD)是一類發(fā)病率高且后果嚴(yán)重的先天畸形,受遺傳和環(huán)境交互作用的影響。孕婦葉酸缺乏是導(dǎo)致NTD的原因之一,但是在孕婦葉酸不缺乏的情況下,仍有一些因素可導(dǎo)致NTD發(fā)生。表觀遺傳修飾在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起了重要作用,PcGs(Polycomb groups)蛋白被認(rèn)為是其核心部分。目前,人們多關(guān)注PcG蛋白是通過影響下游基因參與細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育,卻很少有人報(bào)道上游哪些機(jī)制調(diào)控著PcG蛋白表達(dá)。Micro
2、RNAs(miRNAs)是一類與轉(zhuǎn)錄后基因沉默有關(guān)的小RNA分子。MiRNAs是否在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中能夠調(diào)節(jié)PcG蛋白的表達(dá)目前仍不清楚。此外,PcG蛋白與細(xì)胞凋亡密切相關(guān),動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,神經(jīng)上皮細(xì)胞凋亡過度,是導(dǎo)致神經(jīng)管閉合延遲,引發(fā)NTD。細(xì)胞凋亡是否與胎兒NTD發(fā)生直接相關(guān)目前仍不清楚。本研究從PcG蛋白的表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞凋亡兩個(gè)角度深入探討導(dǎo)致神經(jīng)管畸形發(fā)生的分子機(jī)制。
研究目的:
在母親葉酸不缺乏的
3、情況下,研究PcGs家族蛋白在神經(jīng)管畸形兒神經(jīng)和胎盤組織中的表達(dá)調(diào)控,探討神經(jīng)管畸形兒發(fā)育過程中神經(jīng)和胎盤組織中細(xì)胞凋亡的發(fā)生規(guī)律。
研究方法:
1.利用電化學(xué)發(fā)光法,檢測NTD組和對(duì)照母親血清葉酸水平。
2.利用Western blot技術(shù),檢測Polycomb家族核心蛋白EZH2,SUZ12,EED和BMI1在NTD兒和對(duì)照組兒神經(jīng)組織和胎盤組織中的表達(dá)。
3.利用PicTar
4、,Targetscan和miRanda等生物信息學(xué)軟件預(yù)測可能調(diào)節(jié)表達(dá)異常的PcG蛋白-EED的microRNA(miRNA)。
4.運(yùn)用TaqMan MicroRNA Arrays檢測預(yù)測的靶基因?yàn)镋ED的miRNA在胎盤和神經(jīng)組織中的表達(dá)。
5.利用RT-Realtime PCR、Western blot、雙熒光素酶活性分析等分子生物學(xué)方法驗(yàn)證miRNAs與EED的相互作用。
6.利用原位末
5、端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)研究NTD組和對(duì)照組在胎盤組織和神經(jīng)組織中的細(xì)胞凋亡發(fā)生狀況。
研究結(jié)果:
1.NTD組和對(duì)照組母親血清葉酸水平均在正常范圍內(nèi),且兩組之間無明顯差異(P=0.4464)。
2.EZH2,SUZ12,BMI1,EED蛋白在NTD組和對(duì)照組的胎盤和神經(jīng)組織均有不同程度的表達(dá)。其中,發(fā)現(xiàn)EED蛋白在NTD組胎盤、大腦皮質(zhì)、脊髓組織中均存在差異表達(dá),在NTD組的胎盤和脊髓組織中表
6、達(dá)明顯升高(P<0.05),在大腦皮質(zhì)中表達(dá)顯著降低(P<0.05)。
3.生物信息學(xué)預(yù)測miR-30b,miR-30c and mi-R181b的靶基因可能為Eed,這些miRNAs與Eed的3'UTR互補(bǔ)的“seed”片段在不同物種間是高度保守的。
4.miRNA與其靶基因存在反向調(diào)節(jié)關(guān)系,為了分析預(yù)測的miRNAs哪些可能調(diào)節(jié)EED的表達(dá),TaqMan MicroRNA Arrays是被用來檢測miRN
7、A在胎盤和神經(jīng)組織中的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)miR-30b在脊髓組織和大腦皮質(zhì),miR-30c胎盤組織及miR-181b在脊髓組織中與EED存在反向表達(dá),提示了miR-30b,miR-30c和miR-181b均有可能調(diào)控EED的表達(dá),其調(diào)控關(guān)系可能受組織特異性影響。
5.雙熒光素酶活性分析顯示,miR-30b和miR-30c與包含“seed”片段PGL3-EED3'-UTR的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞能顯著降低酶活性,提示miR-30b和mi
8、R-30c的“seed”片段作用于Eed的3'-UTR區(qū),Eed為miR-30b和miR-30c的靶基因。
6.利用Western blot和Real Time PCR檢測過表達(dá)或敲低miR-30b,miR-30c或miR-181b后內(nèi)源性EED蛋白和mRNA水平的表達(dá)發(fā)現(xiàn),升高miR-30b或miR-30c,EED蛋白水平明顯下調(diào)(P<0.05);降低miR-30b或miR-30c,EED蛋白水平明顯上調(diào)(P<0.05)
9、,其mRNA水平均沒有明顯變化。無論升高或降低mi-R181b,EED蛋白水平和mRNA水平均沒有明顯變化。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了miR-30b和miR-30c均可調(diào)節(jié)EED的表達(dá)。
7.在體研究胎盤和神經(jīng)組織中的細(xì)胞凋亡水平發(fā)現(xiàn),在大腦皮質(zhì)NTD組的細(xì)胞凋亡指數(shù)低于對(duì)照組(p<0.05);胎盤絨毛組織細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯大于正常胎盤絨毛組織的細(xì)胞凋亡指數(shù)(p<0.01)。
結(jié)論:
1、在非葉酸缺乏的
10、神經(jīng)管發(fā)育缺陷過程中,Polycomb家族蛋白表達(dá)分布具有組織特異性,且EED蛋白在胎盤和神經(jīng)組織中均存在差異表達(dá)。
2、在非葉酸缺乏的神經(jīng)管發(fā)育缺陷過程中,miR-30b在NTD組神經(jīng)組織中差異表達(dá),miR-30c在NTD胎盤組織中差異表達(dá)。
3、首次證實(shí)EED是miR-30b和miR-30c的靶基因,且miR-30b和miR-30c可以調(diào)節(jié)內(nèi)源性EED的表達(dá)。
4、在非葉酸缺乏的神經(jīng)管發(fā)育缺
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