Math-1NCG-b基因共轉(zhuǎn)染治療噪聲性聽力損傷的基礎(chǔ)研究.pdf

1、背景:全球十大公害之首已被認為是噪聲污染,由于噪聲引起的聽覺受損是制造業(yè)、農(nóng)業(yè)、航海等最常見的可導(dǎo)致?lián)p傷的因子。另外,隨著發(fā)展中國家的經(jīng)濟進步,建設(shè)噪聲、交通噪聲日益明顯,影響著人們的健康。噪聲性聾是感應(yīng)神經(jīng)性聾,是工業(yè)、交通、建筑中不可避免的損傷,國內(nèi)外醫(yī)學(xué)專家非常重視對噪聲性聽力受損的基礎(chǔ)研究,并且研究中一致認為噪聲聽力損傷發(fā)病機制可以大致分為2類:第一類為組織機械應(yīng)力性損傷:噪聲震波引起內(nèi)耳系統(tǒng)模型組織的剪切應(yīng)力損傷,淋巴液外流,

2、并可使內(nèi)耳正常毛細胞和正常支持細胞結(jié)構(gòu)的破壞,靜纖毛結(jié)構(gòu)在同一時間內(nèi)耳毛細胞內(nèi)出現(xiàn)異常;長期高頻噪聲的代謝性創(chuàng)傷:長期噪聲環(huán)境下不光使心血管系統(tǒng)發(fā)生障礙,更使聽覺代謝的環(huán)境發(fā)生物質(zhì)循環(huán)障礙,毛細胞傳遞信號需要的能量上升。消耗氧及消耗糖在毛細胞和支持細胞的靜息也增加,局部組織出現(xiàn)相對缺氧,三價陽離子負荷增加及二價鈣離子在細胞內(nèi)上升,引起靜纖毛核苷酸合成錯誤,氨基酸合成異常,毛細胞在耳蝸缺氧環(huán)境下面臨著的破壞和程序性的調(diào)亡。但噪聲性聽覺損傷

3、二十世紀就針對性的治療研究不多,仍處于探索階段,治療效果不肯定,這是各國軍事醫(yī)學(xué)所面臨的難題。國內(nèi)有少量文獻資料報道,利用左慈丸等滋陰的中成藥方法治療噪聲性聽力損害,其療效評價也不一,無法使絕大多數(shù)重度耳聾恢復(fù)。仿生學(xué)的治療是二十一世紀對噪聲性聽力創(chuàng)傷的治療的主要方法。通過采取助聽器放大和人工耳蝸改善傳遞,因此其效果直接接受到螺旋神經(jīng)元數(shù)目的影響。人造耳蝸的產(chǎn)生和應(yīng)用是聽力損傷醫(yī)療的一個重要突破,目前對于治療重度和極重度雙耳聽力損傷最常

4、用、效果最確切的方法。但是,由于其不能影響感覺上皮對各個頻段音頻刺激進行精準處理,因此使用了人造耳蝸的病人仍然不可能完全清晰的分辨各個頻段音頻刺激。于是,人們關(guān)注聽覺毛細胞的分化再生,這將有可能為噪聲性耳聾提出新的思路,并且彌補人工耳蝸使用的局限。近年來,基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展為噪聲性聽力損傷的治療的治療提供了新的理論基礎(chǔ)和手段。
　　 目的:各種環(huán)境下的噪聲所導(dǎo)致感音神經(jīng)性耳聾嚴重影響人們的生活、工作和學(xué)習(xí),是人們急需解決的問

5、題之一。通過將調(diào)控毛細胞分化的基因Math-1基因和促進毛細胞生長的基因NGF-b基因共轉(zhuǎn)染動物內(nèi)耳的系列研究,觀察Math-1/NGF-b基因共轉(zhuǎn)染是否對噪聲性聽力損傷具有保護作用,兩者是否具有協(xié)同增強恢復(fù)聽力作用,為噪聲性聽力損傷提供新理論和物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 方法:本實驗采用聽力正常(ABR篩選聽力閾值20dB)成年豚鼠35只,體重在250-300g之間。在穩(wěn)態(tài)噪音混音條件下(穩(wěn)態(tài)噪音混音室內(nèi),四周和中點噪音強度相差度≤10

6、dBA,噪音頻段性質(zhì)達到中心頻率為3000 Hz的窄帶F噪音,寬度控制于1000 Hz。噪聲110dB,每次8小時,連續(xù)3天,每次即時測定ABR。每2小時以聲級計測試保證聲源和功放工作穩(wěn)定),制造耳聾豚鼠模型,用ABR檢測篩選出耳聾達標豚鼠(閾移達到60dB)。將噪聲模型動物分為4組分別為空病毒對照組(5只),Math-1/NGF-b組(10只),Math-1組(10只)和NGF-b組(10只),將各組豚鼠分別轉(zhuǎn)染帶有Math-1/NG

7、F-b,Math-1和NGF-b的腺病毒,對照組轉(zhuǎn)染空病毒。構(gòu)建攜帶Math-1/NGF-b,Math-1和NGF-b三種序列的5環(huán)腺病毒過表達載體,并且根據(jù)腺病毒的滴度公式: T=101+d(s-0.5)/0.1ml(其中,d=Log10稀釋度,如為10倍稀釋梯度則d=1,S=各濃度細胞病變比率之和),使病毒滴度達到1012/ml。對豚鼠右耳通過圓窗膜進行轉(zhuǎn)染,實驗組分別轉(zhuǎn)染Math-1/NGF-b,Math-1和NGF-b,對照組轉(zhuǎn)

8、染空病毒。給予同一只豚鼠左耳行同樣的操作但不轉(zhuǎn)染。最后分別在第3,7,14日分別進行ABR測試,觀察耳聾豚鼠聽力恢復(fù)情況,取右側(cè)耳蝸膜性組織進行掃描電鏡觀察內(nèi)耳毛細胞形態(tài)(基因轉(zhuǎn)染組每組5只),RT-PCR檢驗與免疫組化觀察基因轉(zhuǎn)染情況(基因轉(zhuǎn)染組每組5只),以及毛細胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)及不同治療組之間的差別。
　　 結(jié)果:1.噪聲性耳聾豚鼠模型構(gòu)建成功,在噪聲暴露首個8小時,經(jīng)過不連續(xù)噪聲暴露總計時間達到24小時的豚鼠,其聽力閾移高達

9、60dB,并且跟蹤3日ABR檢測聽力不能恢復(fù)。掃描式電子顯微鏡檢查下,各段毛細胞明顯出現(xiàn)缺失,并且以第三、第四回最為明顯,第一、第二回次之。
　　 2.腺病毒載體構(gòu)建及動物內(nèi)耳轉(zhuǎn)染成功:構(gòu)建了攜帶Math-1/NGF-b,Math-1,NGF-b的腺病毒過表達載體,備制腺病毒滴度均以達到1012/ml。成功對噪聲性耳聾豚鼠的右耳進行完整圓窗膜下過表達腺病毒載體轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后對豚鼠聽力損害小(5±1.6dB)。
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10、.轉(zhuǎn)染后3日。ABR測試:Math-1/NGF-b組及其Math-1組豚鼠ABR提示聽力已有恢復(fù),且Math-1/NGF-b組恢復(fù)較好(Math-1/NGF-b組約5±1.8dB,Math-1組5±0.9dB),差異相比轉(zhuǎn)染前有顯著性(P=0.03＜0.05)。但是NGF-b組及空病毒對照組ABR未見有明顯聽力恢復(fù)。掃描式電子顯微鏡:Math-1/NGF-b組及其Math-1組豚鼠耳蝸毛細胞損壞量比轉(zhuǎn)染前有所減輕(Math-1/NGF-

11、b組約6±0.7個,Math-1組5±1.3個),差異相比轉(zhuǎn)染前有顯著性(P=0.02＜0.05),并且觀測到的毛細胞上纖毛的排列僅呈現(xiàn)為階梯狀,未顯示倒三角形排列,為新生毛細胞。免疫組織化學(xué):Math-1/NGF-b組、Math-1組、NGF-b組均可見轉(zhuǎn)染后表達的增強綠色熒光,在毛細胞及其周圍的基底細胞處表達明顯,但是僅有Math-1/NGF-b組、Math-1組出現(xiàn)少量MyoVIIa陽性的新生毛細胞,NGF-b組及其空病毒對照組未

12、見MyoVIIa陽性細胞。
　　 4.轉(zhuǎn)染后7日。ABR測試:Math-1/NGF-b組、Math-1組及其NGF-b組豚鼠ABR提示聽力均有所恢復(fù),但是Math-1/NGF-b組、Math-1組明顯好于NGF-b組(Math-1/NGF-b組約8±3.1dB,Math-1組7±2.9dB,NGF-b組4±1.3dB),差異相比轉(zhuǎn)染前有顯著性(P=0.02＜0.05)。但是空病毒對照組ABR仍然未見有明顯聽力恢復(fù)。掃描式電子顯微

13、鏡: Math-1/NGF-b組、Math-1組和NGF-b組豚鼠耳蝸毛細胞損壞量比轉(zhuǎn)染前有所減輕,Math-1/NGF-b組最好,Math-1組次之(Math-1/NGF-b組8±0.4個,Math-1組6±1.1個,NGF-b組3±1.2),差異相比轉(zhuǎn)染前有顯著性(P=0.03＜0.05),并且觀測到的毛細胞上纖毛的排列僅呈現(xiàn)為階梯狀,未顯示倒三角形排列,為新生毛細胞。免疫組織化學(xué): Math-1/NGF-b組、Math-1組、NG

14、F-b組均有轉(zhuǎn)染后表達的增強綠色熒光,在毛細胞及其周圍的基底細胞處表達明顯。Math-1/NGF-b組、Math-1組出現(xiàn)的MyoVIIa陽性的新生毛細胞明顯增多,并且以Math-1/NGF-b組居多(×200鏡下,Math-1/NGF-b組17±3.2個,Math-1組12±1.7個),而NGF-b組也出現(xiàn)少許MyoVIIa陽性的新生毛細胞,空病毒對照組未見MyoVIIa陽性細胞,各組間差異有顯著性(P＞0.05)。
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15、.轉(zhuǎn)染后14日。ABR測試:Math-1/NGF-b組、Math-1組及其NGF-b組豚鼠ABR提示聽力有所恢復(fù),是Math-1/NGF-b組、Math-1組明顯好于NGF-b組(Math-1/NGF-b組約13±2.2dB,Math-1組9±1.3dB,NGF-b組6±2.2dB),差異相比轉(zhuǎn)染前有顯著性(P=0.02＜0.05)。空病毒對照組ABR仍然未見有明顯聽力恢復(fù)。掃描式電子顯微鏡:Math-1/NGF-b組、Math-1組、

16、NGF-b組豚鼠耳蝸毛細胞損壞量比轉(zhuǎn)染前有所減輕,Math-1/NGF-b組最好,Math-1組次之(Math-1/NGF-b組約12個,Math-1組8個,NGF-b組4個),且差異相比轉(zhuǎn)染前有顯著性(P=0.02＜0.05)并且觀測到的毛細胞上纖毛的排列僅呈現(xiàn)為階梯狀,未顯示倒三角形排列,為新生毛細胞?？詹《緦φ战M掃描電鏡未見有明顯毛細胞損傷減輕及新生毛細胞。免疫組織化學(xué):Math-1/NGF-b組、Math-1組、NGF-b組均有

17、轉(zhuǎn)染后表達的增強綠色熒光,在毛細胞及其周圍的基底細胞處表達明顯。Math-1/NGF-b組、Math-1組出現(xiàn)的MyoVIIa陽性的新生毛細胞增多,并且以Math-1/NGF-b組居多(×200鏡下,Math-1/NGF-b組17±3.2個,Math-1組12±1.7個),而NGF-b組也出現(xiàn)MyoVIIa陽性的新生毛細胞也有增加但與7日相比無顯著性,空病毒對照組未見MyoVIIa陽性細胞。
　　 結(jié)論:1.非連續(xù)噪聲暴露24小

18、時豚鼠聽力閾移達60dB,跟蹤3日ABR檢測聽力不能恢復(fù)。2.成功構(gòu)建了攜帶Math-1/NGF-b,Math-1,NGF-b的5環(huán)腺病毒。3.Math-1/NGF-b組,Math-1組、NGF-b組轉(zhuǎn)染后都可見豚鼠聽力恢復(fù),但是Math-1/NGF-b組,Math-1組恢復(fù)時間早,效果好,并且Math-1/NGF-b組比Math-1組恢復(fù)更明顯。4.總之,Math-1/NGF-b轉(zhuǎn)染對于豚鼠噪聲性聽力損害的保護作用明顯優(yōu)于單基因轉(zhuǎn)染。