淫羊藿甙抗腫瘤的基因表達(dá)變化與意義研究.pdf

1、背景 誘導(dǎo)分化療法是一種治療惡性腫瘤的新方法，其理論基礎(chǔ)是：惡性腫瘤細(xì)胞喪失了正常分化的能力，表現(xiàn)為分化障礙及失控性增殖；利用分化誘導(dǎo)劑可以使腫瘤細(xì)胞部分或全部恢復(fù)分化潛能，轉(zhuǎn)變?yōu)檎＜?xì)胞或?qū)е录?xì)胞凋亡，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。與傳統(tǒng)的細(xì)胞毒療法相比，其目的不在于殺傷腫瘤細(xì)胞，因而具有較小的毒性。 早在1986年，我國(guó)學(xué)者首先應(yīng)用全反式維甲酸(ATRA)誘導(dǎo)分化治療急性早幼粒細(xì)胞白血病，獲得成功，開創(chuàng)了腫瘤治療史上最為成

2、功的先例。APL的特點(diǎn)是t(15，17)易位和PML/RARα融合基因，系15號(hào)染色體上的PML與17號(hào)染色體上的RARα形成PML/RARα融合基因，這是APL發(fā)病及用維甲酸治療有效的分子基礎(chǔ)。應(yīng)用ATRA誘導(dǎo)分化APL細(xì)胞，完全緩解率可達(dá)85％，并發(fā)癥少，無骨髓抑制，一般不會(huì)誘發(fā)DIC，ATRA現(xiàn)已列為APL誘導(dǎo)緩解治療的首選藥物。目前APL已由出血嚴(yán)重、預(yù)后兇險(xiǎn)轉(zhuǎn)為大部分可取得完全緩解、預(yù)后良好的白血病。 但是，近年來有多

3、篇報(bào)道ATRA能引起較為嚴(yán)重的副作用，如維甲酸綜合征、高組胺血癥、高顱壓綜合癥、高白細(xì)胞綜合征等，若不及時(shí)診治可以引起死亡[2]。而且，快速發(fā)生的耐藥性也是ATRA治療APL的一大缺點(diǎn)。ATRA誘導(dǎo)CR后單用ATRA維持治療的多數(shù)患者易在短期內(nèi)復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)后臨床上往往對(duì)ATRA產(chǎn)生耐藥，再用ATRA治療療效不佳；此外，少數(shù)初治的APL病例亦對(duì)ATRA不敏感。故ATRA抵抗成為臨床甚為棘手的問題。盡管一些可能的機(jī)理已經(jīng)被提出，但目前APL對(duì)

4、ATRA耐藥的機(jī)理仍不清楚，而且克服耐藥的治療策略仍未建立。 因此，尋找新的高效低毒分化誘導(dǎo)劑以及其誘導(dǎo)分化機(jī)制的研究已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外腫瘤基礎(chǔ)與臨床研究的重點(diǎn)之一。1992年，我國(guó)學(xué)者發(fā)現(xiàn)應(yīng)用三氧化二砷治療急性早幼粒細(xì)胞白血病，緩解率也高達(dá)65％-98％[3]，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PML/RARα蛋白也可能是As2O3作用的“靶分子”之一。As2O3毒副作用小，長(zhǎng)期應(yīng)用無慢性砷中毒表現(xiàn)，與ATRA及其他化療藥物無交叉耐藥，經(jīng)ATRA治療

5、取得緩解的急性早幼粒細(xì)胞白血病患者，復(fù)發(fā)后使用三氧化二砷治療可獲得很高療效，As2O3是一種理想的誘導(dǎo)分化劑，目前已經(jīng)在臨床廣泛使用。中藥雄黃治療白血病在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中應(yīng)用已有相當(dāng)長(zhǎng)的歷史，其主要成分為硫化砷(As4S4)，近年，雄黃中提純的硫化砷治療APL已取得滿意療效。此外，羥基喜樹堿(CAM)[4]、六亞甲基雙乙酰胺(HMBA)[5]、咐醇脂(TPA)[6]、高三尖杉酯鹼(HHT)[7]、1，25(OH)2D3[8]等也被用來進(jìn)行白血

6、病誘導(dǎo)分化的體內(nèi)外研究。淫羊藿甙(ICA)是從小蘗科草本植物朝鮮淫羊藿中提取的主要活性成分，具有多種生物化學(xué)效應(yīng)，是一種新型的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑和誘導(dǎo)分化劑。前期研究已經(jīng)證明其可以明顯地誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化[9，10]。而對(duì)于其誘導(dǎo)分化的分子機(jī)制，目前的研究還不多見。 基因表達(dá)譜芯片是目前應(yīng)用最為廣泛的基因芯片，其將數(shù)千個(gè)特異性基因的探針或其cDNA固定在一片芯片上，對(duì)不同細(xì)胞或組織內(nèi)mRNA或逆轉(zhuǎn)錄cDNA進(jìn)行檢測(cè)，從而大規(guī)模分析這

7、些基因在不同條件下表達(dá)的差異性，利用表達(dá)譜芯片大規(guī)模、高通量和并行處理的優(yōu)點(diǎn)，可以繪制一張反映不同條件下個(gè)相關(guān)基因表達(dá)的時(shí)空?qǐng)D，同時(shí)通過生物信息學(xué)方法，對(duì)各基因的表達(dá)譜進(jìn)行比較和統(tǒng)計(jì)分析，找到發(fā)生差異表達(dá)的基因，確定不同基因在表達(dá)上的相關(guān)性，為進(jìn)一步探索這些基因的功能提供線索。在白血病誘導(dǎo)分化方面，基因表達(dá)譜芯片的應(yīng)用才剛剛起步，但在闡明其發(fā)生機(jī)制過程中，基因表達(dá)譜芯片已經(jīng)顯示了無可比擬的優(yōu)越性，通過對(duì)白血病誘導(dǎo)分化基因表達(dá)譜的研究，深

8、入了解白血病誘導(dǎo)分化的分子機(jī)制，有助于從基因水平上完善白血病的誘導(dǎo)分化治療方案。 目的 目前腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)之一是探討腫瘤細(xì)胞增殖與分化的調(diào)控機(jī)制，腫瘤的發(fā)生在于細(xì)胞的失控性生長(zhǎng)，其中與生長(zhǎng)分化有關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)障礙則是增殖失控的至關(guān)重要的因素。生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子作為細(xì)胞增殖的重要胞外刺激因素，與相應(yīng)受體結(jié)合后，主要通過RAS/MAPK和JAK/STAT兩條途徑來實(shí)現(xiàn)信號(hào)傳導(dǎo)[11]。絲裂原活化蛋白激酶家族(mitogena

9、ctivatedproteinkinases，MAPK)作為類絲/蘇氨酸蛋白激酶，是一組具有蘇氨酸和酪氨酸殘基的雙磷酸化能力的蛋白激酶，p38/p42MAPK是其中與增殖、分化、凋亡有關(guān)的重要成員[12]；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子家族(signaltransductorsandactivatoroftranscription，STAT)是一類由細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等多肽類配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，由STAT1-4、STAT5a、STAT5b、ST

10、AT6七個(gè)成員組成，STAT1和STAT3是其中的兩個(gè)重要成員，通過Jak(ianuskinase)家族成員而活化，參與了對(duì)細(xì)胞增殖與分化的調(diào)控[13]。 ICA能夠抑制HL-60細(xì)胞增殖，并能夠誘導(dǎo)其分化和凋亡，本研究旨在探討JAK/STAT與RAS/MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑在ICA誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化中的作用，研究?jī)蓷l途徑與ICA誘導(dǎo)分化的相關(guān)性，尋找ICA誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化的作用靶點(diǎn)，借助基因表達(dá)譜芯片這一分子生物學(xué)高新

11、技術(shù)，進(jìn)一步從分子和基因水平上研究ICA參與誘導(dǎo)分化的機(jī)制，為ICA的臨床應(yīng)用提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 常規(guī)HL-60細(xì)胞培養(yǎng)，加入ICA進(jìn)行誘導(dǎo)分化，并設(shè)不加藥組為陰性對(duì)照組，加ATRA組為陽性對(duì)照組，用瑞氏染色觀察細(xì)胞形態(tài)，MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞增殖的變化，NBT還原實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞分化狀態(tài)，RT-PCR方法檢測(cè)STAT1、STAT3、p38MAPK、p42MAPK在細(xì)胞誘分前后mRNA水平上表達(dá)的變化，基因表達(dá)譜芯片

12、檢測(cè)細(xì)胞誘分前后基因表達(dá)的變化。 結(jié)果 ICA與ATRA在體外作用12h時(shí)，表現(xiàn)出對(duì)HL-60細(xì)胞增殖的抑制作用，24h、48h到72h，增殖抑制作用呈逐漸增大趨勢(shì)，在相同的時(shí)相，ATRA的抑制作用更為明顯，24h后與ICA比較，差異有顯著性。24h后ICA和ATRA均表現(xiàn)出明顯的分化誘導(dǎo)作用，表現(xiàn)為隨著時(shí)間的推移，NBT陽性百分率逐漸增高，但在相同的時(shí)相，以ATRA的作用更為明顯。HL-60細(xì)胞經(jīng)ICA作用24h后，隨

13、著細(xì)胞增殖降低和分化的發(fā)生，在mRNA水平上，p42MAPK表達(dá)增加，STAT3表達(dá)降低，STAT1和p38MAPK未見明顯的表達(dá)，在加ATRA組，p42MAPK表達(dá)增加，STAT3表達(dá)降低，p38MAPK未見明顯的表達(dá),而STAT1的表達(dá)是增加的。芯片結(jié)果顯示HL-60細(xì)胞在ICA處理24h前后共有31條基因表達(dá)發(fā)生改變，其中表達(dá)上調(diào)的基因有9條，表達(dá)下調(diào)的基因有22條,參與細(xì)胞增殖、凋亡和分化的多種基因的表達(dá)水平發(fā)生了明顯改變。

14、 結(jié)論 ICA抑制HL-60細(xì)胞增殖，并能夠誘導(dǎo)其分化，p42MAPK和STAT3與ICA誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化有關(guān)，而p38MAPK和STAT1則與ICA誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化無關(guān)。JAK/STAT與RAS/MAPK兩條信號(hào)傳導(dǎo)途徑均參與了ICA對(duì)HL-60細(xì)胞的分化過程，p42MAPK和STAT3有可能是ICA誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化的作用靶點(diǎn)，芯片結(jié)果證明各個(gè)相關(guān)基因的上調(diào)與下調(diào)可能與ICA抑制HL-60細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其