基因重組腫瘤相關(guān)抗原MAGE-1的表達(dá)及其抗腫瘤研究.pdf

1、研究背景及目的；黑色素瘤抗原基因家族(MAGEgenefamily)主要包括四個(gè)亞家族：MAGE-A，MAGE-B，MAGE-C和MAGE-D，它們分別位于X染色體的Xq28，Xp21.3，Xq26和Xp11。其中MAGE-A又包含12個(gè)基因，從MAGE-1至MAGE-12。MAGE-1基因位于X染色體長(zhǎng)臂末端，基因片段長(zhǎng)4.5kb，含有3個(gè)外顯子，其轉(zhuǎn)錄的mRNA全長(zhǎng)1722bp。MAGE-1編碼的腫瘤相關(guān)抗原MZ2-E為單鏈的多肽，

2、包含309個(gè)氨基酸殘基。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外大量文獻(xiàn)報(bào)道，MAGE-1基因在肝癌、食管癌、胃癌、舌癌、白血病、頭頸癌、肺癌、骨肉瘤、膀胱癌、卵巢癌、睪丸癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤等常見腫瘤中都有較高的表達(dá)率，而在正常組織、炎癥組織及良性腫瘤組織中無(wú)該類基因的表達(dá)。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)8個(gè)由MAGE-1基因編碼的HLA-Ⅰ類分子限制的CTL表位。因此，利用MAGE-1抗原作為腫瘤疫苗用于腫瘤病人的特異性免疫治療具有廣闊的前景。 本研究利用分子生物學(xué)技

3、術(shù)，克隆并在體外高效表達(dá)MAGE-1基因。構(gòu)建MAGE-1基因疫苗，并在細(xì)胞水平和動(dòng)物個(gè)體水平進(jìn)行抗腫瘤生物活性方面的研究。為腫瘤的輔助ELISA檢測(cè)、腫瘤的生物學(xué)治療和瘤苗的研制奠定基礎(chǔ)。 材料和方法 從人肝細(xì)胞性肝癌(HCC)組織中提取總RNA，通過RT-PCR擴(kuò)增出MAGE-1基因，酶切鑒定后。將其插入pGEM-TEasy載體，對(duì)其進(jìn)行序列測(cè)定并與GenBank已知序列進(jìn)行同源性分析。再將其克隆至原核表達(dá)載體pGE

4、X-4T-1和真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，并分別在大腸桿菌BL21(DE3)和人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721進(jìn)行表達(dá)。取健康人外周血，分離樹突狀細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞。用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法分別用質(zhì)粒pcDNA3.1-MAGE-1和pcDNA3.1轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞。再分別用轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MAGE-1的SMMC-7721細(xì)胞、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1的SMMC-7721細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的野生型SMMC-7721細(xì)胞的凍融抗原攻擊樹

5、突狀細(xì)胞，使其激活T淋巴細(xì)胞成為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢測(cè)CTL對(duì)野生型SMMC-7721細(xì)胞的殺傷活性。用真核表達(dá)重組子pcDNA3.1-MAGE-1預(yù)先免疫C57小鼠，以空質(zhì)粒pcDNA3.1和PBS為對(duì)照，每隔10天一次，共3次。末次免疫后第5天用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法檢測(cè)小鼠血清中MAGE-1抗體，ELISA檢測(cè)脾細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-2和IFN-γ的含量。第6天給小鼠接種鼠源肝癌細(xì)胞H22，觀察其成瘤

6、期及生存期。 結(jié)果；1.從人肝細(xì)胞性肝癌(HCC)組織中擴(kuò)增并克隆的MAGE-1基因與GenBank中已報(bào)道的MAGE-1基因序列相比較，僅有4個(gè)堿基存在差異，分別是：719位A→G，835位C→T，847位G→A，1438位C→T。其余完全相同，同源性為99.7％。其中，只有719位A→G導(dǎo)致第32位氨基酸的改變：蘇氨酸→丙氨酸(Thr→Ala)，其余堿基改變均未引起氨基酸的改變。而且，第32位氨基酸的改變并不引起整個(gè)蛋白質(zhì)二

7、級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。 2.PCR及測(cè)序結(jié)果顯示，克隆入原核表達(dá)載體pGEX-4T-1的基因序列與從HCC中擴(kuò)增并克隆的MAGE-1基因一致，是MAGE-1基因。 3.經(jīng)1mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)4h，MAGE-1基因在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)即達(dá)高峰,SDS-PAGE及凝膠密度掃描分析表明，目的蛋白約57kD,占菌體總蛋白的23％。 4.PCR及測(cè)序結(jié)果顯示，克隆入真核表達(dá)載體p

8、cDNA3.1的基因序列與從HCC中擴(kuò)增并克隆的MAGE-1基因一致，是MAGE-1基因。 5.將真核表達(dá)重組子pcDNA3.1-MAGE-1轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞SMMC-7721后，SMMC-7721細(xì)胞的MAGE-1基因表達(dá)量顯著增高。 6.轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MAGE-1質(zhì)粒的SMMC-7721細(xì)胞、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1質(zhì)粒的SMMC-7721細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的野生型SMMC-7721細(xì)胞的凍融抗原所激活的CTL對(duì)野生型S

9、MMC-7721細(xì)胞的殺傷活性無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 7.接種pcDNA3.1-MAGE-1的小鼠血清中均產(chǎn)生了MAGE-1抗體，而pcDNA3.1組和PBS組小鼠均沒有產(chǎn)生MAGE-1抗體。 8.接種pcDNA3.1-MAGE-1的小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-2的含量為108.67±12.81pg/ml，IFN-γ的含量為：372.33±10.08pg/ml。而pcDNA3.1組和PBS組小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-2

10、和IFN-γ的含量幾乎為0。 9.接種pcDNA3.1-MAGE-1的小鼠在接種腫瘤后生存期為17.36±1.598天，pcDNA3.1組生存期為13.13±1.727天，PBS組生存期為12±1.069天。pcDNA3.1-MAGE-1組與其他兩組存在顯著性差異(P＜0.01)。 結(jié)論；1.成功克隆MAGE-1基因，發(fā)現(xiàn)其具有基因多態(tài)性，但所表達(dá)的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)一致； 2.成功構(gòu)建原核表達(dá)重組子pGEX-4T-1