人ndrg2兩亞型基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白的表達(dá)、純化與抗腫瘤作用的研究.pdf

1、人ndrg2(N-myc downstream regulated gene 2)基因是本課題組用消減雜交法從人腦內(nèi)克隆得到的一個(gè)抑癌候選基因，已被Gen Bank收錄，登錄號(hào)為AF159092。它定位于染色體14q11.1-11.2，具有兩個(gè)亞型，分別編碼含有357個(gè)氨基酸殘基和含有371個(gè)氨基酸殘基、分子量約為43kDa的蛋白質(zhì)。ndrg2為Ndrg基因家族成員之一，該家族成員有4個(gè)：ndrg1，ndrg2，ndrg3，ndrg4，

2、且該基因家族成員的氨基酸組成在從低等生物到高等生物的進(jìn)化中有相當(dāng)高的保守性，以上提示該基因家族在細(xì)胞的生命過(guò)程起著重要作用。本課題組初步研究結(jié)果顯示，該基因在多種正常組織中高表達(dá)，而在某些腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞系中低表達(dá)或無(wú)表達(dá)，比如發(fā)現(xiàn)該基因在肺癌和肝癌中的表達(dá)明顯低于相應(yīng)的癌旁組織，還發(fā)現(xiàn)該基因在體外可抑制多種腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)，如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞系BT325具有抑制細(xì)胞增殖的功能，推測(cè)該基因可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，因此提出ndrg2

3、可能為新的候選抑癌基因。但其作用的具體機(jī)制尚不清楚。
　　首先，本課題構(gòu)建了兩種人ndrg2亞型原核重組體pPROEX-HTb-ndrg2并進(jìn)行表達(dá)、純化、濃縮和鑒定。根據(jù)人ndrg2基因序列設(shè)計(jì)合成特異引物，PCR擴(kuò)增，亞克隆入6×His融合表達(dá)載體pPROEX-HTb，在大腸桿菌BL21中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)，并用Protino Ni-TED Resin進(jìn)行純化。試驗(yàn)結(jié)果表明構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后分別可見(jiàn)約1100bp

4、大小的片段，與預(yù)期結(jié)果一致，基因測(cè)序結(jié)果表明序列正確。在IPTG的誘導(dǎo)下重組體分別表達(dá)出分子量約45kd(含多克隆位點(diǎn)及His標(biāo)簽)的表達(dá)產(chǎn)物，Western blot結(jié)果證實(shí)重組6×His融合蛋白可與抗-ndrg2蛋白抗體發(fā)生特異性反應(yīng)；并通過(guò)Protino Ni-TED Resin成功獲得了純化蛋白。通過(guò)本試驗(yàn)，兩種人ndrg2亞型基因分別被亞克隆至6×His融合表達(dá)載體pPROEX-HTb中，并獲得成功表達(dá)和純化，為該蛋白的生物活

5、性及抑瘤作用的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　其次，本課題對(duì)純化的ndrg2-357以及ndrg2-371兩種蛋白進(jìn)行抑制腫瘤作用活性的檢測(cè)。首先我們大量誘導(dǎo)表達(dá)ndrg2-357以及ndrg2-371兩種蛋白，并采用Protino Ni-TED Resin進(jìn)行純化，采用超濾離心管進(jìn)行蛋白的濃縮以及蛋白緩沖液的替換，定量后進(jìn)行體外試驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)膠質(zhì)瘤U251、BT325及肺腺癌A549等腫瘤細(xì)胞的抑制作用，觀察ndrg2-371蛋白的抗腫瘤活