缺氧再給氧損傷和CsA對(duì)MHC-I分子相關(guān)抗原表達(dá)變化的影響及益生注液干預(yù)初探.pdf

1、目的：器官移植已成為當(dāng)今治療臟器功能衰竭終末期疾病的有效手段之一，隨著急性免疫排斥逐漸被克服，慢性移植物失功(chronicgraftdysfunctionCGD)日益成為移植領(lǐng)域面臨的主要難題。缺血再灌注損傷(ischemia/reperfusioninjuryIRI)在任何器官移植中目前尚無法完全避免，被認(rèn)為與移植物慢性失功的發(fā)生密切相關(guān)。 MICA、B(MajorHistocompatibilitycomplexclass

2、Ⅰchain-relatedantigenA，B)即MHC-Ⅰ類鏈相關(guān)基因A、B，被認(rèn)為是人類“誘生性”(induced)細(xì)胞表面抗原，正常情況下在上皮細(xì)胞、角朊細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等表面可檢測(cè)到表達(dá)，而在組織細(xì)胞受到過度應(yīng)激(如熱休克，CMV感染)的情況下會(huì)誘生表達(dá)或上調(diào)表達(dá)—“cellstresssensor”。MIC的配體NKG2D是一種凝集素樣細(xì)胞毒性激活受體，表達(dá)于人NK細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、γδT細(xì)胞等表面。。本文建立了細(xì)胞體外缺

3、氧再給氧(hypoxia/reoxygenationH/R)損傷模型，模擬移植器官IRI損傷，首次在此模型上探討IRI能否介導(dǎo)MIC的表達(dá)變化；同時(shí)首次研究CsA是否能影響MIC在人正常肝細(xì)胞上的表達(dá)。 益生注射液(YishengInjectionYS)是一種活血化瘀的純中藥制劑，我室多年的前期研究表明：益生注射液能減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞的缺氧再給氧損傷；降低血瘀癥大鼠血液粘度；減緩大鼠腹主動(dòng)脈移植時(shí)強(qiáng)化缺血再灌注損傷引起的血管硬化；

4、減輕離體睪丸和移植腎的缺血再灌注損傷。本文在前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討益生注射液對(duì)于缺氧再給氧損傷后MIC表達(dá)變化的干預(yù)效果。 方法1)建立細(xì)胞體外缺氧再給氧損傷模型，采用人正常肝細(xì)胞(HL-7702)，利用Jouan三氣培養(yǎng)箱設(shè)置理想缺氧環(huán)境——37℃，5％CO2，1％O2，94％N2。達(dá)到不同缺氧時(shí)間后，隨即恢復(fù)正常氣體環(huán)境繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)中選取15h和延長缺氧至22h兩個(gè)不同的缺氧時(shí)間，再給氧時(shí)間分別設(shè)定為2h、4h、6h、1

5、2h、24h。 2)通過逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)的方法半定量檢測(cè)處理前后肝細(xì)胞MICA、B在mRNA水平的變化；同時(shí)利用細(xì)胞爬片免疫熒光染色的方法，從蛋白質(zhì)水平檢測(cè)MIC在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化。 3)用益生注射液對(duì)肝細(xì)胞缺氧再給氧損傷模型進(jìn)行干預(yù)，在缺氧前后的培養(yǎng)液中分別加入mg/ml的YS，同樣用RT-PCR和免疫熒光的方法檢測(cè)MIC變化情況。 4)在正常人肝細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的CsA(5μ

6、g/ml20μg/m1)，共育1h、3h、5h、8h、24h。利用細(xì)胞爬片免疫熒光染色的方法，從蛋白質(zhì)水平檢測(cè)MIC在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況。 結(jié)果1)正常肝細(xì)胞(HL-7702)在未給予任何處理的情況下，mRNA及蛋白質(zhì)水平均可檢測(cè)到低水平的MICA、B表達(dá)，用人正常肝組織石蠟切片的免疫組化染色同樣證實(shí)了上述結(jié)果，MIC主要表達(dá)在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜，但細(xì)胞漿中亦可見少量表達(dá)。 2)缺氧15h再給氧2h，MICAmRNA開

7、始增加，與對(duì)照組比較有顯著差異(P＜0.05)；再給氧6h、12h、24h，MICAmRNA上調(diào)表達(dá)的程度基本維持一致，組間無明顯差異(P＞0.05)。從缺氧15h再給氧2h起，MICBmRNA表達(dá)增加，與對(duì)照組比較有顯著差異(P＜0.05)；且再給氧4h、6h、12h、24h，MICBmRNA上調(diào)表達(dá)的程度亦基本維持一致，組間無明顯差異(P＞0.05)。免疫熒光與RT-PCR的結(jié)果基本吻合。 3)延長缺氧時(shí)間至22h，MICA

8、和MICBmRNA上調(diào)表達(dá)的時(shí)間延遲，均從再給氧24h起才開始增加，與對(duì)照組比較有顯著差異(P＜0.05)。 4)HL-7702細(xì)胞在正常情況下表現(xiàn)為圓形貼壁生長，缺氧后大部分細(xì)胞回縮呈梭形，細(xì)胞間隙明顯增寬，部分細(xì)胞脫落。加入益生注射液干預(yù)后，細(xì)胞形態(tài)有所改善，脫落細(xì)胞明顯減少；MICA、B在mRNA和蛋白質(zhì)水平的上調(diào)表達(dá)均被有效抑制，與正常對(duì)照組比較未見顯著差異(P＞0.05)。 5)5μg/ml和20μg/ml的C

9、sA與人肝細(xì)胞共育，作用1h后，肝細(xì)胞表面MIC抗原表達(dá)開始上調(diào)，至3h和5h達(dá)最高峰(P＜0.05)，共育8h-24h后，MIC表達(dá)回落至正常水平(P＞0.05)。使用相同體積百分比的乙醇溶劑作為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)乙醇單獨(dú)作用并不能使肝細(xì)胞表面MIC的表達(dá)發(fā)生變化(P＞0.05) 結(jié)論1)MIC主要表達(dá)在人正常肝細(xì)胞的細(xì)胞膜，但細(xì)胞漿中亦有少量表達(dá)。 2)缺氧再給氧損傷能夠造成MICA、B的上調(diào)表達(dá)，從再給氧2h起開始相對(duì)于對(duì)