hCUL4A過(guò)表達(dá)對(duì)缺氧-缺血-再供氧-再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制初探.pdf

1、缺氧/缺血性損傷廣泛存在于包括癌癥、中風(fēng)以及神經(jīng)退行性疾病等多種疾病中，再供氧/再灌注會(huì)導(dǎo)致DNA損傷的積累從而加重缺氧/缺血造成的損傷。缺氧/缺血-再供氧/再灌注會(huì)導(dǎo)致非正常折疊或受損蛋白的積聚，這些蛋白大多被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)清除。泛素介導(dǎo)的蛋白降解作用由底物蛋白的泛素化以及26S蛋白酶體參與的蛋白降解構(gòu)成。泛素化包括了分別由E1激活酶、E2結(jié)合酶及E3連接酶催化的泛素激活、耦聯(lián)以及轉(zhuǎn)移三個(gè)級(jí)聯(lián)步驟。其中，E3連接酶決定了泛素化修飾

2、的底物專一性。以cullin環(huán)為基礎(chǔ)的E3是E3酶中最大的家族之一，Cullin4A(CUL4A)是該家族的核心成員之一。CUL4A通過(guò)參與p53、p27和Cdt1等相關(guān)蛋白的降解過(guò)程，在腫瘤抑制、細(xì)胞成活、DNA損傷響應(yīng)、細(xì)胞增殖以及基因組穩(wěn)定性的維持等方面發(fā)揮了重要的作用。盡管有證據(jù)暗示表達(dá)上調(diào)的Cul4A有可能參與到細(xì)胞對(duì)缺氧/缺血-再供氧/再灌注導(dǎo)致的損傷的響應(yīng)中，但是CUL4A在這一過(guò)程中的具體作用仍不得而知。在本研究中，我們

3、構(gòu)建了人源CUL4A(human CUL4A，hCUL4A)的腺病毒表達(dá)載體，通過(guò)病毒轉(zhuǎn)染將hCUL4A成功導(dǎo)入了PC12細(xì)胞以及大鼠腦中。在隨后的研究中，我們對(duì)CUL4A在缺氧/缺血-再供氧/再灌注導(dǎo)致的損傷中的功能及其作用機(jī)制作了初步探索。
　　 一、缺氧-再供氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞Cul4A基因表達(dá)
　　 目的:檢測(cè)PC12細(xì)胞中內(nèi)源Cul4A基因?qū)θ毖?再供氧(hypoxia-reoxygenation，H/R)處理

4、的響應(yīng)。
　　 方法:我們首先根據(jù)前人研究中的描述，建立PC12細(xì)胞H/R體系。通過(guò)檢測(cè)缺氧后培養(yǎng)液氧分壓(partial pressure of oxygen，pO2)的變化及細(xì)胞缺氧后缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1 alpha，HIF-1α)蛋白的表達(dá)確認(rèn)缺氧體系的有效性。然后，在PC12細(xì)胞缺氧1.5 h，分別再供氧0.5、1、2、3、4和8h提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行半定量RT-PCR檢

5、測(cè)內(nèi)源Cul4A表達(dá)。
　　 結(jié)果:缺氧后無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液中pO2升高，PC12細(xì)胞缺氧3h后細(xì)胞內(nèi)HIF-1α蛋白表達(dá)升高。半定量RT-PCR的結(jié)果顯示，PC12細(xì)胞中內(nèi)源Cul4A在H/R處理1～4 h之內(nèi)被誘導(dǎo)至正常水平的三倍左右，隨后在8h時(shí)下降到接近正常水平。
　　 結(jié)論:細(xì)胞缺氧系統(tǒng)是有效、穩(wěn)定可靠的。PC12細(xì)胞內(nèi)源Cul4A基因受H/R誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，Cul4A可能會(huì)參與到PC12細(xì)胞對(duì)H/R損傷的細(xì)胞響應(yīng)中。

6、
　　 二、人CUL4A重組腺病毒載體的構(gòu)建及其在PC12細(xì)胞中的表達(dá)特點(diǎn)
　　 目的:為研究CUL4A的表達(dá)上調(diào)在PC12細(xì)胞H/R損傷中的作用，我們需要首先構(gòu)建攜帶有綠色熒光蛋白(green fluorescence protein，GFP)報(bào)告基因及hCUL4A基因的腺病毒表達(dá)載體，并研究其在PC12細(xì)胞中的表達(dá)特點(diǎn)。
　　 方法:擴(kuò)增hCUL4A基因，并通過(guò)In-Fusion PCR克隆技術(shù)構(gòu)建穿梭質(zhì)粒p

7、DC315-hCUL4A-EGFP，利用AdMaxTM腺病毒包裝系統(tǒng)將該穿梭質(zhì)粒與腺病毒表達(dá)載體骨架質(zhì)粒pBHG lox△E1，E3 Cre共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，經(jīng)GFP熒光檢測(cè)和Western印跡檢測(cè)確認(rèn)hCUL4A的表達(dá)后，進(jìn)一步通過(guò)病毒擴(kuò)增及純化得到hCUL4A重組腺病毒載體Ad-hCUL4A-GFP。將該載體轉(zhuǎn)染PC-12細(xì)胞，觀察hCUL4A-GFP融合蛋白在PC-12細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:成功得到了較高滴

8、度的腺病毒載體Ad-hCUL4A-GFP（1.6×1012 pfu/ml）。熒光結(jié)果表明，Ad-hCUL4A-GFP在轉(zhuǎn)染滴度大于1.6×109 pfu/mL情況下，在轉(zhuǎn)染8h后即可在PC12細(xì)胞中檢測(cè)到表達(dá)。Hoechst33342染色的結(jié)果還表明轉(zhuǎn)染的hCUL4A主要在PC12細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。GFP熒光信號(hào)的檢測(cè)以及western blot的結(jié)果還表明，hCUL4A在PC12細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率及蛋白表達(dá)水平依賴于腺病毒的轉(zhuǎn)染時(shí)長(zhǎng)和

9、轉(zhuǎn)染滴度。
　　 結(jié)論:腺病毒載體Ad-hCUL4A-GFP構(gòu)建成功，掌握了其在PC12細(xì)胞中的最佳轉(zhuǎn)染條件及時(shí)空表達(dá)模式。
　　 三、過(guò)表達(dá)人CUL4A對(duì)PC12細(xì)胞缺氧-再供氧損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制探討
　　 目的:初步探討過(guò)表達(dá)hCUL4A在PC12細(xì)胞H/R損傷中的作用及機(jī)制。
　　 方法:將Ad-hCUL4A-GFP轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞，再對(duì)細(xì)胞進(jìn)行H/R處理。通過(guò)WST-1檢測(cè)細(xì)胞活力、Hoech

10、st33342染色細(xì)胞核研究細(xì)胞所處的凋亡階段、加入蛋白酶體抑制劑MG132處理細(xì)胞、單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)DNA損傷及western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白caspase3、Bcl-2、p53、p27等的表達(dá)，對(duì)CUL4A在H/R中的作用及機(jī)制進(jìn)行研究。
　　 結(jié)果:WST-1檢測(cè)結(jié)果顯示，PC12細(xì)胞H/R后，與空載體對(duì)照vector組相比，hCUL4A轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞活力明顯增加（87.25％±1.75％vs.70.94％±3.

11、39％，P＜0.01）。Hoechst33342染色結(jié)果表明，H/R后，相對(duì)于vector組，hCUL4A轉(zhuǎn)染組的PC12細(xì)胞處于凋亡Ⅰ期和Ⅱa期的細(xì)胞明顯減少，總凋亡率得到顯著抑制（24.77％±1.55％ vs.40.73％±2.34％，P＜0.01）。加入蛋白酶體抑制劑MG132（50μmol/L）后，hCUL4A過(guò)表達(dá)對(duì)總凋亡細(xì)胞數(shù)的影響作用受到抑制。單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明，PC12細(xì)胞經(jīng)H/R處理后，hCUL4A過(guò)表達(dá)組細(xì)

12、胞中帶彗星尾的細(xì)胞（即DNA損傷細(xì)胞）在總體細(xì)胞中所占比例比vector組少60.39％（中位數(shù)=11.11％ vs.28.05％，P＜0.01）;并且過(guò)表達(dá)hCUL4A組尾距(tail moment，TM)值比vector組明顯降低（中位數(shù)=4.88 vs.10.43，P＜0.01）。western blot結(jié)果顯示，在PC12細(xì)胞中，由H/R誘導(dǎo)的caspase3活性上調(diào)明顯被hCUL4A的過(guò)表達(dá)所抑制;與此相對(duì)應(yīng)，hCUL4A的過(guò)

13、表達(dá)組中抗凋亡因子Bcl-2的蛋白水平也明顯比vector組高。另外，過(guò)表達(dá)hCUL4A還能有效抑制由H/R引起的p53和p27表達(dá)上調(diào)。
　　 結(jié)論:在H/R引起的PC12細(xì)胞損傷中，hCUL4A過(guò)表達(dá)可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白，如上調(diào)抗凋亡因子Bcl-2，抑制caspase3的活性，下調(diào)p53和p27的蛋白表達(dá)，并減少DNA的損傷，從而使細(xì)胞凋亡率下降，細(xì)胞活力升高。
　　 四、過(guò)表達(dá)hCUL4A對(duì)大鼠腦缺血再灌注

14、損傷的保護(hù)作用
　　 目的:初步探索hCUL4A在大鼠腦缺血-再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)損傷中的作用。
　　 方法:將Ad-hCUL4A-GFP通過(guò)大鼠右側(cè)側(cè)腦室立體定位注射轉(zhuǎn)染大鼠腦，經(jīng)基因表達(dá)及蛋白表達(dá)檢測(cè)確認(rèn)病毒注射后3d時(shí)hCUL4A能在大鼠腦中表達(dá)后，我們選取病毒注射后3d進(jìn)行大鼠大腦中動(dòng)脈梗塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型建立

15、。大鼠MCAO再灌注后24 h取腦進(jìn)行TTC染色檢測(cè)大腦梗塞體積及水腫程度;3d取腦對(duì)缺血中心區(qū)及缺血半影區(qū)的大腦皮層進(jìn)行神經(jīng)組織病理學(xué)檢測(cè)（HE染色）;對(duì)MCAO再灌注后2～72 h的大鼠連續(xù)進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分（neurological severity score，NSS，Longa評(píng)分法）。
　　 結(jié)果:TTC染色結(jié)果顯示，與空載體對(duì)照vector組相比，hCUL4A組的腦梗塞體積減少約54.35％（中位數(shù)=187.42

16、 vs.410.60 mm3，P＜0.01），腦水腫程度也明顯減輕（中位數(shù)=1.069 vs.1.110，P＜0.05）。HE染色結(jié)果顯示，與vector組相比，hCUL4A組的大鼠腦缺血中心區(qū)以及缺血半影區(qū)的水腫程度較輕;紅色神經(jīng)元或鬼影細(xì)胞較少，神經(jīng)元主要發(fā)生缺氧性損傷的改變而非vector組中表現(xiàn)的神經(jīng)元壞死;CUL4A組中出現(xiàn)了較多增生肥大的星形膠質(zhì)細(xì)胞，同時(shí)伴有毛細(xì)血管密度的增加（比vector組增加1.7倍）。NSS評(píng)分結(jié)果

17、顯示，與vector組相比，hCUL4A過(guò)表達(dá)組的大鼠在MCAO再灌注24、48和72 h后的NSS評(píng)分明顯下降。
　　 結(jié)論:hCUL4A過(guò)表達(dá)能有效減少由I/R造成的大鼠腦梗塞體積及減輕腦水腫程度，有可能會(huì)延緩神經(jīng)元壞死的進(jìn)程，并且促進(jìn)腦I/R損傷后神經(jīng)組織的修復(fù)，從而促進(jìn)腦I/R后大鼠神經(jīng)行為的有效恢復(fù)。
　　 綜上所述，我們的結(jié)果揭示了過(guò)表達(dá)hCUL4A在PC12細(xì)胞以及大鼠腦中對(duì)缺氧/缺血-再供氧/再灌注造成的