提高乙型肝炎病毒P基因區(qū)PCR檢測陽性率的策略及阿德福韋酯治療中HBV基因型耐藥臨床監(jiān)測研究.pdf

1、抗病毒治療是改善慢性乙型肝炎患者預后、提高生活質量的主要措施。核苷(酸)類似物的臨床應用極大地改善了病人的病情。理論上,所有口服核苷(酸)類似物在治療過程中均可出現耐藥性,HBV對核苷類抗病毒藥物產生的耐藥性是阻礙其臨床應用、降低其療效的主要原因。因此在慢性HBV感染抗病毒治療中進行耐藥基因監(jiān)測對于指導臨床用藥,包括撤換或增加其他核苷(酸)類似物十分重要,倍受臨床重視。HBV基因變異已經被證明與HBV的耐藥性有直接的因果關系。HBV變異

2、的出現可通過基因型檢測來診斷,而PCR產物直接測序的方法能夠鑒定已知的并發(fā)現新的變異位點。為了鑒定潛在的基因型耐藥,在病毒學突破時分離提取的HBV DNA序列及其推導出的氨基酸序列需與患者治療前標本的序列和野毒株序列相對比以確定導致對某種抗病毒藥物耐藥的位點替換。長期以來,人們對PCR假陰性問題認識不足。在實際應用中有許多因素可能造成假陰性結果,要成功地得到靶序列的擴增,PCR要求模板、引物、dNTP、DNA聚合酶和緩沖液之間的無數復雜

3、相互作用。由于HBV DNA的P基因區(qū)是非保守區(qū),檢測時可能會由于引物結合區(qū)的堿基的變異而出現假陰性結果。因此提高HBVP基因區(qū)PCR的檢測陽性率,是了解病毒變異情況的前提,它對在慢性HBV感染抗病毒治療中進行耐藥基因監(jiān)測具有十分重要的意義。本研究采用一些綜合措施提高了HBV DNA P基因區(qū)PCR檢測的陽性率。在此基礎上,建立了包含有拉米夫定、阿德福韋及恩替卡韋耐藥相關突變位點堿基P基因區(qū)的PCR檢測方法,并以阿德福韋酯治療乙肝病人為

4、研究對象,擴增病人不同治療觀察點血清HBVDNA,進行DNA序列分析,動態(tài)監(jiān)測HBV基因型耐藥變化。 第一部分：提高乙型肝炎病毒P基因區(qū)PCR檢測陽性率的策略 目的提高HBV DNA P基因區(qū)PCR檢測的陽性率,了解病毒基因型耐藥與臨床耐藥之間相互關系。 方法： (1)通過采用①比較7種HBV DNA抽提技術的DNA抽提得率,②優(yōu)化PCR反應條件,③選擇最佳引物,④降低退火溫度,⑤3'末端堿基游移兼并引物

5、以減少引物與模板引物結合區(qū)的錯配對PCR的影響等五種方法,對常規(guī)PCR檢測HBV DNA P基因區(qū)陰性的病人血清再進行PCR檢測。 (2)以372例拉米夫定治療失敗乙肝病人為研究對象,擴增病人血清HBV DNA,進行DNA序列分析,監(jiān)測HBV基因型耐藥變化。 結果： ①在7種抽提方法中血清直接沸水浴、經典的蛋白酶裂解+酚/氯仿抽提法、蛋白酶裂解+酚/氯仿抽提法省缺乙醇沉淀以及柱抽提法的HBV DNA抽提得率分別為

6、75.2％、13.8％、21.9％、31.0％；用堿變性裂解和蛋白酶裂解后沸水浴所得上清,以及血清直接作為模板,PCR后不能得到陽性擴增條帶；沸水浴時間在5～7分鐘能獲得最多的PCR產物。 ②本研究條件下,優(yōu)化的PCR反應條件確定為：采用直接沸水浴法抽提血清HBV DNA;模板上樣量5μl,10×PCR緩沖液5μl,MgCl2(25mmol/L)3μl,4×dNTP(10mmol/L)1μl,上、下游引物各12.5pmol,Ta

7、q DNA聚合酶1U,用去離子水補充至總體積50μl;PCR反應過程：94℃預變性5分鐘；94℃變性30秒,53℃退火30秒,72℃延伸45秒,共38循環(huán)；72℃再延伸5分鐘。 ③通過降低退火溫度及減少3'末端錯配,PCR檢測陽性率由81.7％(67/82)增加至92.7％(76/82)(P<0.05)。 ④372例病人拉米夫定平均治療時間為30.35±6.82月,來自不同病人的372份血清標本中P基因區(qū)PCR陽性339

8、份,陽性率91.1％；所有陽性標本均測序成功。測序結果經與野生株YMDD基序基因比對后,共檢出YMDD變異193株(51.2％),其中M240I 104株(28.0％),M204V 68株(18.3％),M204V/I混合變異株18株(4.84％),CVDD(半胱氨酸-纈氨酸-天門冬氨酸-天門冬氨酸)1株(0.27％),YMDH(酪氨酸-蛋氨酸-天門冬氨酸-組氨酸)1株(0.27％),YMHD/YIHD(酪氨酸-異亮氨酸-天門冬氨酸-組

9、冬氨酸)混合變異1株(0.27％)。 結論： ①核酸抽提方法選擇不當能直接影響基因檢測的靈敏度,導致基因定量準確性下降。血清直接沸水浴法HBV DNA得率高、操作簡便、省時、經濟,值得推薦。 ②綜合采用優(yōu)化PCR反應條件,選擇引物,降低退火溫度以及應用3'末端堿基游移兼并引物等方法可提高基因高突變區(qū)PCR檢測陽性率。 ③拉米夫定治療失敗乙肝病人存在較高比例HBV YMDD基序變異,最常見變異為M240I、

10、M204V和M204V/I混合變異株。 第二部分：阿德福韋酯治療中HBV基因型耐藥臨床監(jiān)測研究 目的：觀察阿德福韋酯治療慢性乙肝病人是否存在相關基因自然變異和變異病毒株處于優(yōu)勢地位的發(fā)生時間,以期了解基因型耐藥與臨床耐藥之間相互關系,并對基因型耐藥發(fā)生的相關危險因素進行分析。 方法：56例口服賀維力(阿德福韋酯片10mg,每日一次)病人,在治療前(基線)、治療第4周、第12周、第24周、第36周、第48(或52)

11、周分別采集血清標本。標本進行肝功能全套、HBV血清標志物檢測,HBV DNA定量檢測。HBV DNA陽性者,采用已建立的包含有拉米夫定、阿德福韋及恩替卡韋等已知耐藥相關突變位點堿基HBV P基因區(qū)的PCR檢測方法,動態(tài)監(jiān)測病毒基因型耐藥變化。 結果： ①阿德福韋治療48周時,56例病人中出現病毒學無應答病人2例,病毒學突破病人12例,共占被研究人數25％(14/56)。 ②56例病人基線血清均獲得PCR陽性結果,

12、并測序成功。測序結果顯示：除1例發(fā)生rt233ATA-GTA的堿基置換外,所有病例基線優(yōu)勢病毒株均與野生株一致,48周治療結束時,該病人獲得完全生化學和病毒學應答；基線時,4例病人存在相關位點的氨基酸變異非優(yōu)勢株,但病人未出現病毒學無應答或病毒學突破。 ③出現病毒學無應答或病毒學突破的14例病人,不論在基線還是在治療48周后均未檢測到已知相關位點堿基變異。 ④Logistic逐步回歸表明,患者性別、年齡、HBeAg狀態(tài)、