慢性乙型肝炎患者阿德福韋酯耐藥的檢測(cè)與分析.pdf

1、研究背景和目的: 慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）治療的關(guān)鍵為抗乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）治療。目前被我國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局（State Food and Drug Administration，SFDA）批準(zhǔn)用于抗HBV治療的藥物主要包括兩類：干擾素類與核苷（酸）類似物類，后者包括拉米夫定（lamivudine，LAM）、阿德福韋酯（adefovir dipiv

2、oxil，ADV）、替比夫定（telbivudine，LdT）與恩替卡韋（entecavir，ETV）。其中ADV自上市以來，在CHB患者，尤其是LAM耐藥患者中被廣泛應(yīng)用。但隨著ADV治療時(shí)間延長(zhǎng)，ADV耐藥的問題逐漸凸顯。目前關(guān)于ADV耐藥相關(guān)的HBV反轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase，rt）區(qū)變異位點(diǎn)報(bào)道較多，如rtV84M、rtS85A、rtV214A、rtQ215S、rtI233V與rtN238T/D等，但公

3、認(rèn)的ADV耐藥相關(guān)的HBV變異為rtA181V/T與rtN236T。ADV治療e抗原（HBeAg）陰性的核苷（酸）類似物初治CHB患者1～5年累積耐藥發(fā)生率分別為0％、3％、11％、18％與29％?；颊叱霈F(xiàn)ADV耐藥相關(guān)變異后，可以相繼出現(xiàn)病毒學(xué)突破、生化學(xué)突破、肝炎發(fā)作與肝功能失代償?shù)?。因此定期監(jiān)測(cè)、早期發(fā)現(xiàn)ADV耐藥并給予有效的挽救治療對(duì)于有效地控制HBV感染具有重要意義。在ADV耐藥的監(jiān)測(cè)中，血清HBV DNA檢測(cè)是重要的篩查指標(biāo)

4、。但是血清HBV DNA除受到ADV耐藥影響外，還與患者依從性、患者應(yīng)用藥物的質(zhì)量、藥物代謝因素以及體內(nèi)病毒的自然波動(dòng)等相關(guān)，而特異性的ADV耐藥檢測(cè)則是確診患者ADV基因型耐藥的方法。 現(xiàn)已報(bào)道的ADV基因型耐藥（genotypic resistance）的檢測(cè)方法包括：聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物直接測(cè)序法、克隆測(cè)序法、線性探針反向雜交法、聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法

5、（restriciton fragment length polymorphism，RFLP）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法與限制性片段質(zhì)譜多態(tài)性（restriciton fragment mass polymorphism，RFMP）等方法。在這些方法中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法目前尚未應(yīng)用于臨床檢測(cè)；線性探針反向雜交法與RFMP法價(jià)格昂貴；克隆測(cè)序法操作非常繁瑣而且價(jià)格昂貴。目前國(guó)內(nèi)ADV耐藥檢測(cè)應(yīng)用最廣泛的是PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法與PCR-RF

6、LP法。PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法目前多采用雙脫氧測(cè)序法（di-deoxy sequencing），其缺點(diǎn)為檢測(cè)敏感度較低，只有當(dāng)變異病毒占體內(nèi)病毒群20％～30％以上時(shí)方可檢出。PCR-RFLP法成本相對(duì)低廉，但僅針對(duì)已知變異，對(duì)每種變異均需設(shè)計(jì)特異性引物與酶切位點(diǎn)，且受到操作人員以及酶切體系影響較大。隨著ADV耐藥問題的逐漸凸顯，臨床上迫切需要有較高敏感度與特異度、操作簡(jiǎn)便、自動(dòng)化程度高并且價(jià)格相對(duì)低廉的耐藥檢測(cè)方法。 基因芯片技

7、術(shù)用于疾病診斷具有高通量與高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，它用于LAM耐藥的檢測(cè)已有報(bào)道，檢測(cè)HBV DNA下限為2～3 log10拷貝/mL，可于病毒群中檢出>10％變異株。另外焦磷酸測(cè)序法作為一種新興的測(cè)序方法，已有報(bào)道用于LAM耐藥檢測(cè)，同樣具有高通量與高靈敏度特點(diǎn)，并可于病毒群中檢出>10％變異病毒。目前尚無基因芯片法與焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)ADV耐藥的報(bào)道。 因此，我們收集ADV治療出現(xiàn)病毒學(xué)突破或治療48周未達(dá)到病毒學(xué)應(yīng)答的CHB患者的血

8、清樣本與臨床資料，采用PCR產(chǎn)物雙脫氧測(cè)序法、焦磷酸測(cè)序法與基因芯片法進(jìn)行ADV耐藥檢測(cè)，對(duì)三種方法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。同時(shí)，我們進(jìn)一步比較ADV治療病毒學(xué)突破患者與48周無病毒學(xué)應(yīng)答患者的耐藥發(fā)生情況，分析耐藥相關(guān)因素；并比較HBV基因型與ADV耐藥的相關(guān)性。具體內(nèi)容分述如下： 第一部分：慢性乙型肝炎患者阿德福韋酯耐藥的檢測(cè)方法分析 本部分實(shí)驗(yàn)，我們收集ADV治療出現(xiàn)病毒學(xué)突破或48周末達(dá)到病毒學(xué)應(yīng)答患者的血清，分別應(yīng)用

9、PCR產(chǎn)物雙脫氧測(cè)序法、焦磷酸測(cè)序法與基因芯片法進(jìn)行基因型耐藥檢測(cè)。對(duì)三種檢測(cè)方法的耐藥檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，探討漏檢耐藥變異的原因，并對(duì)變異株在病毒群中所占比率（以下簡(jiǎn)稱變異株比率）做初步探討。 材料和方法： 1.收集ADV治療（10mg/d）出現(xiàn)病毒學(xué)突破（病毒學(xué)突破組）或48周未達(dá)到病毒學(xué)應(yīng)答患者（病毒學(xué)失敗組）血清提取DNA模板，巢式PCR擴(kuò)增后取陽性擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行雙脫氧法測(cè)序，采用NTI Vector9與Chrom

10、as軟件分析測(cè)序結(jié)果。 2.取患者血清提取DNA模板，PCR擴(kuò)增后取陽性擴(kuò)增的產(chǎn)物采用基因科技（上海）HBV耐藥突變焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。采用焦磷酸測(cè)序儀配套分析軟件進(jìn)行變異判斷與變異株比率分析。 3.取患者血清提取DNA模板，PCR擴(kuò)增后取陽性擴(kuò)增的產(chǎn)物采用晶芯（）乙型肝炎病毒耐藥檢測(cè)基因芯片試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果采用晶芯（）乙型肝炎病毒耐藥基因芯片分析軟件進(jìn)行分析。 4.采用t檢驗(yàn)、t'檢驗(yàn)、Wi

11、lcoxon秩和檢驗(yàn)、Pearson非校正法卡方檢驗(yàn)或Yates校正法卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。SPSS11.5軟件用于統(tǒng)計(jì)計(jì)算。 結(jié)論： 1.初步研究表明，PCR產(chǎn)物焦磷酸測(cè)序法的ADV耐藥檢出率優(yōu)于雙脫氧測(cè)序法與基因芯片法。基因芯片法耐藥檢出率與雙脫氧測(cè)序法無顯著性差異。焦磷酸測(cè)序法與雙脫氧測(cè)序法檢測(cè)陽性結(jié)果可以確認(rèn)耐藥，基因芯片法同樣具有較好的陽性預(yù)測(cè)值。 2.PCR產(chǎn)物雙脫氧測(cè)序法漏檢變異位點(diǎn)與患者血清HBV

12、 DNA水平與變異株所占比率相關(guān)。基因芯片法漏檢位點(diǎn)主要血清中變異株的拷貝數(shù)相關(guān)，而與變異株在病毒群中所占比率無直接相關(guān)。 3.無論是ADV治療出現(xiàn)病毒學(xué)突破還是治療48周無病毒學(xué)應(yīng)答患者，其檢出的耐藥變異株在體內(nèi)均可能以非優(yōu)勢(shì)株存在，體內(nèi)變異株比率與患者HBV DNA改變的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。 第二部分：CHB患者ADV耐藥的相關(guān)因素分析 由上部分可知，無論是ADV治療病毒學(xué)突破組患者還是病毒學(xué)失敗組患者均只

13、有部分患者檢出耐藥。因此我們就第一部分中患者的ADV耐藥檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步比較病毒學(xué)突破組與病毒學(xué)失敗組患者的耐藥情況，分析耐藥發(fā)生的相關(guān)因素；并分析HBV基因型與ADV耐藥的相關(guān)性。 材料與方法: 1.患者HBV基因型檢測(cè)，采用巢式PCR方法擴(kuò)增HBV表面抗原（HBsAg）編碼序列，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，將測(cè)序結(jié)果輸入美國(guó)生物技術(shù)信息中心（NCBI）HBV分型軟件進(jìn)行分型。 2.病毒學(xué)突破組與病毒學(xué)失敗組患者ADV

14、耐藥檢測(cè)參照論文第一部分。 3.采用t檢驗(yàn)、t'檢驗(yàn)、Wilcoxon秩和檢驗(yàn)、Pearson非校正法卡方檢驗(yàn)或Yates校正法卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。SPSS11.5軟件用于統(tǒng)計(jì)計(jì)算。 結(jié)論： 1.ADV耐藥變異中，rt181V/T變異較rtN236T變異常見，無論是ADV治療病毒學(xué)突破患者還是治療48周無病毒學(xué)應(yīng)答患者均需進(jìn)行耐藥檢測(cè)以指導(dǎo)抗病毒方案選擇。 2.rtA181T變異可降低ADV治療出現(xiàn)病毒