阿德福韋酯治療慢性乙型肝炎臨床應(yīng)答與耐藥及其分子機(jī)制的初步研究.pdf

1、目前全世界約有3.5億的乙型肝炎病毒(HBV)攜帶者，尋找有效的治療乙型肝炎藥物成為當(dāng)務(wù)之急。慢性乙型肝炎的關(guān)鍵治療是抗HBV治療，目前抗HBV藥物不斷產(chǎn)生，特別是核苷類藥物發(fā)展迅速，核苷類似物有強(qiáng)而迅速抑制HBV的作用，不良反應(yīng)輕，可以口服，患者耐受性好。拉米夫定是脫氧胞嘧啶核苷類似物，具有很強(qiáng)的抑制HBV作用，但隨著療程的延長易出現(xiàn)耐藥，其1、2、3、4年耐藥率分別為14～32％、38％～58％、49％～53％、70％。阿德福韋酯是

2、一種單磷酸腺苷的無環(huán)核苷類似物，對于核苷類似物初治及拉米夫定耐藥患者均有良好的療效。與拉米夫定相比，阿德福韋酯最明顯的優(yōu)勢在于耐藥發(fā)生率低，其1、2、3、4、5年基因型耐藥發(fā)生率分別為0、3％、4％～11％、18％、29％。但在臨床應(yīng)用中觀察到，該藥對部分患者抗病毒能力弱、起效較慢或療效不佳，表現(xiàn)為“次最佳病毒學(xué)應(yīng)答”，即治療48周后HBVDNA水平較基線時(shí)下降小于2log10拷貝/ml。這部分患者即使延長治療時(shí)間也不能取得很好的療效，

3、且不能檢測出有已明確的阿德福韋酯耐藥變異的產(chǎn)生，表明除病毒耐藥因素外，尚有其他因素對其療效產(chǎn)生影響。 目前，HBV準(zhǔn)種的研究日益受到重視。在單一宿主體內(nèi)，當(dāng)反復(fù)的突變累積形成了一個(gè)有著相似基因序列但又存在遺傳學(xué)差異的病毒種群，而又不構(gòu)成新的基因型或亞型時(shí)，這樣一個(gè)病毒種群被稱為準(zhǔn)種(quasispecies)。準(zhǔn)種不是單純的不同突變株的集合，而是相互緊密關(guān)聯(lián)的變異株作為一個(gè)整體而存在，從而決定病毒的生物學(xué)特性。在慢性乙型肝炎抗病

4、毒治療過程中，抗病毒藥物給HBV準(zhǔn)種施加的強(qiáng)大的選擇壓力可能導(dǎo)致藥物靶點(diǎn)耐藥變異毒株的迅速累積，甚至造成準(zhǔn)種群的漂變，這是病毒群體在機(jī)體免疫壓力和抗微生物化療藥物選擇壓力下不斷選擇的結(jié)果。 核苷類似物發(fā)揮抗病毒作用的主要作用位點(diǎn)在HBV逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)區(qū)，該區(qū)核苷酸序列的變化將會(huì)影響藥物抗病毒活性。拉米夫定耐藥相關(guān)位點(diǎn)主要位于HBVRT區(qū)YMDD基序內(nèi)，包括rtM204I(即YIDD)、rtM204V(即YVDD)以及rtM20

5、4S(即YSDD)。研究發(fā)現(xiàn)與YMDD相關(guān)的耐藥株體外復(fù)制能力低于野生株，但位于多聚酶C區(qū)以外的累積變異如rtL180M及rtV173L可以代償性的提高YMDD耐藥株的復(fù)制能力。阿德福韋酯的耐藥產(chǎn)生機(jī)制較為復(fù)雜，其主要變異位點(diǎn)集中在rtN236T和rtA181V。研究發(fā)現(xiàn)這兩種變異在體外只對阿德福韋酯產(chǎn)生低水平的耐藥，而在不同的患者卻可導(dǎo)致不同的HBVDNA動(dòng)力學(xué)的變化，主要包括：①變異發(fā)生的同時(shí)病毒載量反跳至基線水平；②病毒學(xué)突破前數(shù)

6、月即可監(jiān)測到突變株的存在；③病毒變異對療效無影響，患者仍可達(dá)到持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答。在慢性HBV感染者體內(nèi)，隨著機(jī)體免疫功能狀態(tài)的不同，特別是在應(yīng)用不同的抗HBV化療藥物治療以后，HBV的準(zhǔn)種組成、復(fù)雜程度、各突變株所占比例等也發(fā)生變化，藥物敏感株被抑制，耐藥株被篩選，這是HBV對核苷類似物產(chǎn)生耐藥，導(dǎo)致抗病毒治療失敗的重要機(jī)制之一。 基于此，我們以接受阿德福韋酯治療的慢性乙型肝炎患者為研究對象。首先回顧性分析了阿德福韋酯治療核苷類似

7、物初治及拉米夫定耐藥患者的抗病毒療效及其相關(guān)因素。同時(shí)對兩種HBVDNA檢測方法(LightCycler及AmplicorCOBAS)進(jìn)行了比較。其次，對7例慢性乙型肝炎患者接受拉米夫定和阿德福韋酯序貫療法期間血清進(jìn)行了HBVRT區(qū)的PCR直接測序，對1例患者共9份血清樣本進(jìn)行了準(zhǔn)種動(dòng)力學(xué)研究，每份樣本經(jīng)PCR-分子克隆后隨機(jī)選取30個(gè)克隆進(jìn)行測序。通過核酸與氨基酸序列對照分析，了解拉米夫定和阿德福韋酯序貫治療過程中HBVRT區(qū)準(zhǔn)種的分

8、布、組成及演化及其與病毒學(xué)應(yīng)答間的關(guān)系，以期為抗病毒治療提供一定的理論依據(jù)。 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.34例核苷類似物初治的患者統(tǒng)計(jì)學(xué)分析提示：HBVDNA不可測患者較之其它患者基線HBVDNA水平較低、ALT較高、獲得IVR的比例更高(P=0.034、0.011、＜0.001)；獲得HBeAg/抗-HBe血清學(xué)轉(zhuǎn)換的患者較之未獲轉(zhuǎn)換的患者基線HBVDNA水平較低、獲得IVR的比例更高(P=0.034、＜0.001)；獲得I

9、VR的患者較之未獲得IVR者基線HBVDNA水平較低、ALT水平較高(P=0.006、0.003)。治療52周、104周、132周時(shí)血清HBVDNA下降水平均與體重成負(fù)相關(guān)關(guān)系(P=0.026、0.016、0.035)。 2.57例拉米夫定耐藥患者統(tǒng)計(jì)學(xué)分析提示：HBVDNA不可測患者較之其它患者ALT較高、獲得IVR的比例更高(P=0.012、＜0.001)；獲得HBeAg/抗-HBe血清學(xué)轉(zhuǎn)換的患者較之未獲轉(zhuǎn)換的患者基線HB

10、VDNA水平較低、獲得IVR的比例更高(P=0.018、＜0.001)；獲得IVR的患者較之未獲得IVR者基線HBVDNA水平較低、ALT水平較高(P=0.006、0.004)。 3.3例阿德福韋酯10mg/日治療無效的拉米夫定耐藥患者在阿德福韋酯20mg/日治療24周后HBVDNA水平明顯下降，ALT復(fù)常。無嚴(yán)重不良反應(yīng)發(fā)生。 4.直線回歸分析結(jié)果顯示LightCycler及AmplicorCOBAS兩種方法檢測所得H

11、BVDNA水平的結(jié)果具有相關(guān)性(P＜0.001)。 5.采用PCR直接測序法在6例患者出現(xiàn)拉米夫定治療病毒學(xué)突破時(shí)檢測到拉米夫定相關(guān)耐藥突變。 6.對1例慢乙肝患者接受拉米夫定/阿德福韋酯序貫療法期間血清HBV準(zhǔn)種動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，拉米夫定治療過程前24周，患者HBV準(zhǔn)種存在形式均為野生型。36周、48周分別檢測出少量M204I及M204V+L180M突變株，LAM治療60周時(shí)，HBVDNA水平有所反彈，M204V+L18

12、0M突變株所占比例迅速增加，取代野生型成為優(yōu)勢準(zhǔn)種，并在LAM72周(即ADV基線)時(shí)完全取代野生型，此時(shí)伴有病毒學(xué)突破。換用阿德福韋酯后，M204V+L180M突變株始終為優(yōu)勢準(zhǔn)種，僅在后期有少量野生株及M204I突變株重新出現(xiàn)。 結(jié)論： 1.接受阿德福韋酯治療的核苷類似物初治及拉米夫定耐藥患者中，基線HBVDNA水平較低、ALT水平較高及獲得早期病毒學(xué)應(yīng)答的患者HBVDNA更易達(dá)到檢測限以下及獲得HBeAg/抗-HB

13、e血清學(xué)轉(zhuǎn)換。 2.血清HBVDNA下降水平與體重成負(fù)相關(guān)關(guān)系。隨著體重增加，HBVDNA下降幅度越小，病毒學(xué)應(yīng)答越差，并證實(shí)在高體重患者，通過增加阿德福韋酯給藥劑量，確能增強(qiáng)病毒抑制，同時(shí)并不影響腎功能。 3.LightCycler及AmplicorCOBAS兩種方法檢測所得HBVDNA水平的結(jié)果具有顯著相關(guān)性。 4.在病毒學(xué)突破前24～36周即可檢測出拉米夫定耐藥株存在，耐藥突變株在整個(gè)HBV種群中的比例迅速