耐輻射式球菌雙鏈DNA修復系統(tǒng)RecF途徑的關鍵解旋酶DrRedcQ的結構與功能研究.pdf

1、RecQ作為DNA解旋酶無論是從單細胞的細菌還是到人類對于基因組完整性的保持和維護都起到了十分重要的作用。與其他解旋酶家族類似，RecQ蛋白需要在ATP存在的情況下解旋雙鏈DNA。但是，不同于其他家族的解旋酶，RecQ蛋白有著不同尋常的廣泛的應用活性，包括DNA復制，DNA重組和修復等1。人類如果缺失RecQ基因功能會引起癌癥易感性和早衰。因此，近些年來RecQ家族蛋白引起了廣泛的關注和研究，不僅僅是因為它們對基因組的不穩(wěn)定起到抑制作用

2、，更是因為可以避免人類的某些疾病。
　　 第一個RecQ家族的蛋白是由Nakayama and Umezu通過篩選大腸桿菌發(fā)現(xiàn)的抗胸腺嘧啶缺陷致死的菌株中發(fā)現(xiàn)的2,3。這個蛋白作用在RecF基因重組修復系統(tǒng)中。RecF通路參與同源重組和由紫外線誘導所致的DNA損傷修復中4。RecQ和RecF通路中的其他蛋白幫助修復停止在DNA損傷位點的復制叉5。RecQ蛋白在至今所有得到全基因組序列的生物中都得到了鑒定。三種保守的結構域存在于R

3、ecQ家族蛋白中:Helicase（解旋酶），RecQ-C-terminal(RecQ-Ct)和Helicase-and-RNaseD-like-C-terminal(HRDC)6。在這三種保守結構域中，HRDC結構域形成一個獨立的螺旋束和參與DNA結合反應，尤其是在某種程度上決定了DNA底物的特異性7,8。
　　 雙鏈DNA斷裂被認為是最嚴重的基因組損傷。耐輻射式球菌(D.radiodurans)作為可以耐受極高強度的干旱和離

4、子損傷而造成的大范圍的DNA雙鏈斷裂而得到廣泛認可。因此，其強大的輻射耐受性使耐輻射球菌成為一個研究DNA修復系統(tǒng)的模式生物7。相比于其他所有的RecQ家族的得到鑒定的蛋白質(zhì)，耐輻射式球菌D.radiodurans中的RecQ家族的蛋白DrRecQ在其蛋白質(zhì)序列的C端有三個HRDC結構域。DrRecQ蛋白有著特殊結構域分布的蛋白結構引起了科研學者的廣泛興趣:這種細菌極高的輻射耐受及其高效的DNA損傷修復能力可能就是源于其蛋白質(zhì)結構的特殊

5、性。DrRecQ蛋白各個結構域的截短變異體的體外生化實驗證明在耐輻射式球菌中解旋酶和HRDC結構域對于DrRecQ蛋白質(zhì)功能的發(fā)揮都是至關重要的，并且這三個HRDC結構域在整體功能的發(fā)揮上具有協(xié)同作用9。
　　 本文我們旨在闡明作為被證明是耐輻射式球菌中主要的雙鏈DNA重組修復系統(tǒng)的RecF途徑的第一個關鍵酶DrRecQ的真實功能和調(diào)節(jié)機制的研究。在這篇文章中，我們重點研究了DrRecQ全長蛋白和兩個截短的蛋白——DrRecQ1

6、-824(Helicase+RecQ-Ct+3 HRDC),DrRecQ1-610(Helicase+RecQ-Ct+HRDC1)andDrRecQ1-520(Helicase+RecQ-Ct)的結構和生物化學功能的研究。作為一個解旋酶，在ATP不存在的情況下DrRecQ可以與不同種類的DNA底物結合，但是其結合能力的強弱以DNA底物的不同而有差異。當ATP存在時，DrRecQ可以高效解旋雙鏈DNA和Holliday junction。

7、這里我們應用凝膠電泳遷移分析(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)實驗來檢驗DrRecQ和不同DNA底物的結合強弱及其解旋酶活性的檢測。另外，我們得到了以上三種蛋白的蛋白質(zhì)晶體。但是，DrRecQ全長的晶體結構可能很難得到:因為HRDC1和HRDC2之間的長Loop區(qū)可能會影響晶體的質(zhì)量，也很難對其整體的結構進行細致性的分析。小腳散射（Small Angel X-ray Scatterin

8、g，SAXS）是一種非常強大的生物大分子結構檢測方法，尤其對接近于其生理狀態(tài)的溶液狀態(tài)的生物大分子的結構分析更加有效。我們應用小腳散射的目的首先是希望得到溶液狀態(tài)下全長的DrRecQ蛋白質(zhì)和DrRecQ1-610的結構解析，再次進行DrRecQ蛋白質(zhì)與不同種類的DNA底物的相互作用的研究，最后基于小腳散射的數(shù)據(jù)來對完整的分子結構模型進行構建。目前我們通過對小腳散射的數(shù)據(jù)進行解析對上述兩種蛋白質(zhì)中解旋酶和HRDC在溶液中的模型進行了成功組

9、建。分離得到的部分DrRecQ蛋白質(zhì)的高分辨率結構被應用的小腳散射的數(shù)據(jù)當中用來對比和建模。小腳散射的數(shù)據(jù)通過與DrRecQ1-610的對比得到了完整的DrRecQ1-824全長蛋白質(zhì)的結構。在溶液中兩種蛋白的解旋酶部分都是呈現(xiàn)圓形的結構，但是與晶體結構中不同的是在其中間有空洞出現(xiàn)。從我們得到的所有的實驗數(shù)據(jù)推斷DrRecQ蛋白不僅僅可以在RecF途徑的第一步那樣解旋雙鏈的DNA底物，而且HRDC結構域可以幫助DrRecQ蛋白與Holl