維持耐輻射球菌基因組穩(wěn)定性的關鍵基因recQ的功能及調控網絡研究.pdf

1、耐輻射球菌(Deinococcus radiodurans)是迄今為止發(fā)現的對電離輻射、紫外線、干燥、過氧化氫等一些DNA損傷劑都具有極強抗性的微小球菌，它在DNA雙鏈斷裂修復上具有超強的能力，是目前研究DNA損傷與修復的模式生物。從1999年Deinococcus radiodurans野生株R1全基因組數據公布以來，該細菌的分子結構特征研究，分子防御機制方面和重要修復基因，如recA、ssb、pprI,pprA等在DNA修復機制方面

2、都取得了很大的進展，但還未能清楚揭示耐輻射球菌的修復機理。 RecQ解螺旋酶是解螺旋酶在進化中高度保守的一個亞族，它在維持有機體基因組的穩(wěn)定性中有重要的作用。耐輻射球菌具有兩個特殊結構的RecQ家族成員：DR1289和DR2444，這兩個基因在該細菌中的具體功能都未知。本文主要系統(tǒng)地研究這兩個基因在耐輻射球菌中的作用機制和調控網絡，具體從以下幾個方面進行了研究： 1．先運用生物信息學的方法確定這兩個基因在染色體上的具體位

3、置，對DR1289和DR2444進行了結構域的同源性分析，功能預測和進化樹分析，結果表明DR1289與細菌及真核生物有較近的親緣關系，而DR2444相差較遠。 2．運用PCR突變三段連接法克隆具有自身groEL啟動子、KAT啟動子分別與卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因融合的DNA片段反向重組到基因組中，構建并鑒定了卡那霉素抗性完全突變株△DR1289，氯霉素抗性完全突變株△DR2444，雙突變株△recO。輻射條件下和H<,2>

4、O<,2>氧化壓力下突變株生存率結果表明：△DR2444與R1存活率趨勢線基本一致，而△DRl289和△recQ雙突變株較為敏感。根據上述結果推測，DR1289是一個對R1保持極端抗性的必需基因，而DR2444是非必需基因。 3．分析了突變株△DR1289的一些特性，表型數據表明，敲除掉DR1289這個基因后，突變株對UV，絲裂霉素C，過氧化氫都極敏感，對γ-輻射在超過2 kGy劑量下敏感?！鱀R1289生長與野生株相比較為緩慢

5、；脈沖場電泳表明，無論在正常生長狀況，還是過氧化氫脅迫條件下，該突變株都具有基因組的不穩(wěn)定性，尤其是在20 mM H<,2>O<,2>處理30分鐘后，其基因組圖譜與R1在高劑量輻射和長期干燥脅迫下的圖譜很相似。運用穿梭質粒pRADK進行DR1289各個結構域的功能性補償，表明helicase結構域和3個串聯的HRDC結構域都必不可少。 4．用大腸桿菌表達系統(tǒng)體外表達了DR1289各個結構域的突變蛋白，并進行了純化。我們使用熒光染

6、料H33258，長度為2.7 kbp的線性化雙鏈(HindⅢ-pUC19)片斷作為底物的熒光染色替代法檢測解螺旋酶活性。不同ATP和金屬離子濃度下該蛋白的解螺旋酶活性表明，DR1289的解螺旋酶活性至少與曾經報道過的大腸桿菌的RecQ活性相當。SSB蛋白作為一個解螺旋酶功能促進因子，我們發(fā)現DRl289解螺旋速率能夠被D.radiodurans SSB蛋白提高，且對DR1289蛋白有相同物種專一性的特殊效應。ATPase活性表明heli

7、case結構域對DR1289 ATPase是必需的，而HRDC結構域是達到最適ATPase酶活性所必需的結構域。基于這些實驗，我們推測在耐輻射球菌中，DRl289的C-末端三個串聯的HRDC結構域已經進化，從而應對各種類型的DNA損傷。 5．在DR1289刪除以后，全基因組轉錄譜水平約有9.1％發(fā)生了2倍以上的改變，如鐵離子的代謝，氧化相關基因和細胞分裂相關基因。另外，在20mM H<,2>O<,2>壓力下，突變株許多重要基因如

8、recA，pprA，ddrA，DR0003，DR0070的轉錄水平變化趨勢與野生株在強劑量輻射和長期干燥條件下的趨勢很相象。Western blot分析表明無論在有氧化脅迫條件，還是在正常生長條件下，突變株中RecA水平都上升，表明當DR1289刪除后，體內確實存在較大的DNA損傷，進一步佐證了芯片數據。高錳低鐵可以促使耐輻射球菌的抗性提高，但ICP-MS測定結果顯示DR1289突變體內全鐵含量上升，而全錳含量下降，導致Mn/Fe比例從

9、0.38下降到0.07。而順磁共振實驗表明突變株中的自由鐵量約為野生株的50％。綜上所述，DR1289基因是一個維持耐輻射球菌基因組穩(wěn)定性和貢獻于極端抗性的關鍵基因。 6．為了進一步研究耐輻射球菌DRl289蛋白在極端抗性中的調控機制，通過二維液相色譜ProteomeLab PF 2D目標蛋白快速分離系統(tǒng)分析了野生株R1與功能破壞株△DR1289在20 mM H<,2>O<,2>氧化壓力下蛋白表達譜的差異。 綜上所述，耐