臍血粒系祖細(xì)胞發(fā)育過程中Hoxb8的表達(dá)及干預(yù)研究.pdf

1、目的:本課題主要探討人類臍血造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell,HSC)向粒系(colony forming unit-granulocyte,CFU—G)發(fā)育過程中Hoxb8基因及蛋白的表達(dá)情況,用全反式維甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)和／或三氧化二砷(arsenic trioxide,ATO,As2O3)進(jìn)行干預(yù),探討ATRA與As2O3對(duì)臍血粒系祖細(xì)胞發(fā)育過程中Hoxb8表

2、達(dá)的影響。
　　 方法:1.36例臍血標(biāo)本由本院產(chǎn)房提供,取自正常足月順產(chǎn)新生兒斷臍后的胎盤段臍血。2.實(shí)驗(yàn)分組。實(shí)驗(yàn)分4組:(1)空白對(duì)照組(Normal):不加干預(yù)藥物,代之等量DMEM／F12培養(yǎng)基加入基本培養(yǎng)體系。(2)ATRA組:加入ATRA稀釋液,終濃度6×10—8mol／l。(3)As2O3組:加入As2O3稀釋液,終濃度6×10—8mol／l。(4)ATRA+As2O3組:同時(shí)加入ATRA及As2O3稀釋液,終濃

3、度同上。3.采用造血干細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù),以ATRA和(或)As2O3持續(xù)干擾人類造血干細(xì)胞,觀察正常組、ATRA組、As2O3組、ATRA+As2O3組的造血干細(xì)胞經(jīng)人粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony—stimulating,G-CSF)誘導(dǎo)后,在培養(yǎng)過程第3天,7天和12天的粒系祖細(xì)胞集落(colonyforming unit-granulocyte,CFU-G)生成情況。4.采用瑞氏染色法鑒定粒系祖細(xì)胞集落成

4、分。5.第3天、第7天、第12天分別提取各組細(xì)胞總RNA,用1％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA分子的完整性；并于第3天、第7天、第12天分別提取各組細(xì)胞的核蛋白,用BCA試劑盒測(cè)定各組樣品的蛋白濃度。6.通過隨機(jī)引物將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(fluorogenic quantitive reverse transcriptionpolymerize chain reaction,FQ-RT-PCR

5、)技術(shù)檢測(cè)臍血粒系祖細(xì)胞增殖分化過程中各組HOXB8mRNA的表達(dá)；用Western-blot法檢測(cè)各組樣品的Hoxb8蛋白水平的表達(dá)。7.隨機(jī)抽取逆轉(zhuǎn)錄的Hoxb8基因進(jìn)行電泳分別獲得Hoxb8基因在3天、7天、12天電泳圖。將Hoxb8基因cDNA和人β-肌動(dòng)蛋白(actin beta,ACTB)基因陽(yáng)性產(chǎn)物cDNA梯度稀釋制作各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)各個(gè)樣本循環(huán)指數(shù)增長(zhǎng)期的起始點(diǎn)即循環(huán)域值(cyclethreshold,Ct)和標(biāo)準(zhǔn)曲

6、線斜率計(jì)算各自樣本起始cDNA模板量倍數(shù)值；以ACTB基因作為內(nèi)參照進(jìn)行標(biāo)化；用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定蛋白-抗體復(fù)合物的含量,在凝膠成像系統(tǒng)中成像并測(cè)量特異性條帶表達(dá)強(qiáng)度,將同次電泳所得的Hoxb8和ACTB條帶灰度值相比,得到各樣本Hoxb8／ACTB的灰度比值,每組測(cè)3個(gè)樣本。8.統(tǒng)計(jì)方法:結(jié)果用DNA相對(duì)拷貝數(shù)和RNA表達(dá)相對(duì)量(2-ΔΔCt)表示Hoxb8mRNA相對(duì)表達(dá)量,Hoxb8／ACTB的灰度比值表示Hoxb8蛋白的相對(duì)含量,采

7、用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差((X)±S)表示Hoxb8基因的變化情況。進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),TOW-WAY AONVA方差分析,組間均數(shù)兩兩比較用LSD法,由統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0完成。
　　 結(jié)果:1.集落細(xì)胞的形態(tài)學(xué)鑒定,瑞氏染色法證明所培養(yǎng)的細(xì)胞是粒細(xì)胞。2.1％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳顯示RNA電泳圖的5s,18s,28s三條帶型整齊,無明顯拖尾及彌散,說明RNA結(jié)構(gòu)完整,無明顯降解。3.逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增各組均有目的基因Hoxb8和

8、內(nèi)參照ACTB基因的cDNA的產(chǎn)物,與DNA分子Marker相比示擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為:Hoxb8為96bp,ACTB基因?yàn)?11bp,與預(yù)定理論值大小符合。4.人類造血干細(xì)胞向粒系祖細(xì)胞增殖分化過程中,Hoxb8mRNA及其蛋白第3天少量表達(dá),第7天表達(dá)較強(qiáng)烈,第12天表達(dá)減弱；5.與正常對(duì)照組比較,6×10-8mol／L的ATRA能顯著上調(diào)Hoxb8mRNA及其蛋白的表達(dá),6×10-8mol／L的As2O3對(duì)Hoxb8mRNA及其蛋白

9、的表達(dá)無明顯調(diào)節(jié)作用,6×10-8mol／L的ATRA和6×10-8mol／L的As2O3共同作用對(duì)Hoxb8mRNA及其蛋白的表達(dá)無明顯調(diào)節(jié)作用。
　　 結(jié)論:1.Hoxb8mRNA及其蛋白在臍血粒系祖細(xì)胞增殖分化過程中表達(dá),與粒系造血呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。2.6×10-8mol／L的ATRA能顯著上調(diào)Hoxb8mRNA及其蛋白的表達(dá)。3.6×10-8mol／L的As2O3對(duì)Hoxb8mRNA及其蛋白的表達(dá)無明顯調(diào)節(jié)作用。4.6×