人外周血、臍血、脂肪組織中內(nèi)皮祖細(xì)胞生物特性比較研究.pdf

1、目的：內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPC)是血管內(nèi)皮前體細(xì)胞，存在于外周血、骨髓、臍血中，具有胚胎性成血管特性，參與缺血性疾病血管新生。隨著對(duì)EPC的深入研究，發(fā)現(xiàn)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在一定條件下可分化成內(nèi)皮祖細(xì)胞，促進(jìn)缺血區(qū)域血管生成。脂肪組織在體內(nèi)含量豐富，較易獲取，可能在自體干細(xì)胞移植治療缺血性疾病有較大應(yīng)用前景。正常成人外周血EPC數(shù)量雖少，但外周血干細(xì)胞采集方便，自體移植無(wú)免疫排斥反應(yīng)，因

2、而其臨床應(yīng)用也較多。臍帶和胎盤是臍血EPC良好來(lái)源，采集容易，由于干細(xì)胞處于較幼稚階段，辨識(shí)“自我”與“非我”的能力較骨髓或外周血干細(xì)胞差，可能適用于同種異體干細(xì)胞移植。但這些研究多側(cè)重于獲取容易或理論推測(cè)，未進(jìn)行系統(tǒng)的生物學(xué)特性比較研究。因此本實(shí)驗(yàn)在于研究人外周血、臍血、脂肪組織三種不同來(lái)源內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)特性異同，主要便于根據(jù)不同來(lái)源和特性的內(nèi)皮祖細(xì)胞，探討可能不同的適應(yīng)范圍和方式與方法，提高內(nèi)皮祖細(xì)胞的應(yīng)用效率。 方法：1

3、．采用密度梯度離心分離人外周血、臍血單個(gè)核細(xì)胞，胰蛋白酶消化提取脂肪干細(xì)胞。2．采集細(xì)胞用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基M199(含20％胎牛血清，VEGF、bFGF)誘導(dǎo)分化內(nèi)皮祖細(xì)胞。3．倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。4．培養(yǎng)第7天的爬片細(xì)胞進(jìn)行CD133免疫熒光檢測(cè)，激光共聚焦檢測(cè)攝取Dil-ac-LDL與吸附FITC-UEA-I雙染陽(yáng)性細(xì)胞。5．培養(yǎng)7d貼壁細(xì)胞胰蛋白酶消化，低溫凍存2個(gè)月，復(fù)蘇后細(xì)胞部分行流式細(xì)胞儀檢測(cè)其CD34陽(yáng)性率，部分采

4、用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，Boyden小室檢測(cè)遷移能力，貼壁法檢測(cè)細(xì)胞黏附功能以及血管生成試劑盒檢測(cè)細(xì)胞體外成血管能力。 結(jié)果：1.倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)：剛分離的人外周血、臍血單個(gè)核細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞形態(tài)小，3-4d可見(jiàn)細(xì)胞貼壁，伸展拉長(zhǎng)。7d后貼壁細(xì)胞梭形、紡錘形，形成多個(gè)細(xì)胞簇；剛分離的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞小圓形，24-48h可見(jiàn)細(xì)胞貼壁，梭形細(xì)胞出現(xiàn)較早，7d出現(xiàn)線樣排列結(jié)構(gòu)。2.熒光顯微鏡下觀察到CBMNCs、PBMNC

5、s、ADSCs誘導(dǎo)分化第7d細(xì)胞均可見(jiàn)綠色熒光，CD133陽(yáng)性染色。3.激光共聚焦顯微鏡顯示CBMNCs、PBMNCs、ADSCs誘導(dǎo)分化第7d細(xì)胞出現(xiàn)橙黃色雙染陽(yáng)性，說(shuō)明細(xì)胞攝取Dil-ac-LDL與吸附FITC-UEA-I，證實(shí)其為正在分化的EPC。4.凍存復(fù)蘇后細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34陽(yáng)性細(xì)胞率，CBEPC、PBEPC、ADEPC分別為(72.74±4.6)％，(44.9±4.9)％，(48.7±5.3)％，臍血源性EPC明顯高

6、于后兩者(P<0.01)。5.MTT法檢測(cè)不同來(lái)源EPC增殖功能示CBEPC為(0.775±0.083)，PBEPC為(0.619±0.079)，ADEPC為(0.693±0.053)；前者與后兩者分別相比(P<0.05)。Boyden小室檢測(cè)遷移能力示，CBEPC為(53.53±10.46)，PBEPC為(37.70±9.83)，ADEPC為(34.04±12.72)；前者與后兩者分別相比(P<0.01)。貼壁法檢測(cè)細(xì)胞黏附功能示CB

7、EPC為(83.85±10.39)，PBEPC為(71.86±13.66)，ADEPC為(69.39±13.63)；前者與后兩者分別相比(P<0.05)。血管生成試劑盒檢測(cè)細(xì)胞體外成血管能力觀察到接種細(xì)胞拉長(zhǎng)，成出芽式生長(zhǎng)，形成管狀樹枝樣分叉結(jié)構(gòu)，形成小管情況：CBEPC為(93.09±12.04)，ADEPC為(77.74±6.86)(P<0.01)；PBEPC為(63.84±7.13)與ADEPC相比(P<0.01)。 結(jié)論