人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定及改良凍融法脫細(xì)胞血管支架的建立.pdf

1、血管疾病是目前全球發(fā)病率最高的疾病之一，可由動脈粥樣硬化、創(chuàng)傷、血管瘤以及各種先天性異常等因素引起，而主要治療方法與手段是血管移植術(shù)。據(jù)統(tǒng)計，在美國每年欲進(jìn)行移植血管行動脈旁路術(shù)就高達(dá)10萬例以上。因此，如何進(jìn)一步擴(kuò)大血管移植物的有效來源已經(jīng)成為人們高度關(guān)注的重要課題。目前，血管移植物的臨床來源，主要是異體或自體血管以及人工材料，雖然這些材料可以為諸多的病患進(jìn)行修復(fù)血管提供有利的條件，甚至可以更好地延長病患的生命，但是遠(yuǎn)期效果卻未達(dá)到預(yù)

2、期的理想程度。由于異體或是自體血管的移植分別存有組織相容性比較差，而自體動脈來源也有一定的限制等問題。而人工材料的應(yīng)用也存在著一定的問題，小口徑(內(nèi)徑小于6mm)的血管移植過程之中血管存在著不同程度的高張力、低血流的特殊狀態(tài)，在病患進(jìn)行移植之后，其失敗率也較高。與此同時，這些人工血管不具備生長以及自我修復(fù)功能。組織工程血管，通常是利用細(xì)胞外基質(zhì)作為血管支架，充分、有效地運用組織工程技術(shù)，將人工培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞種植于血管支架上，再通過相

3、關(guān)的技術(shù)手段，使之黏附、分化以及正常生長，同時分泌出ECM，從而構(gòu)建出組織相容性較為良好、無免疫原性、更具較好的持久性與可塑性，且不易鈣化、感染、避免血栓形成的、具有生命力的血管替代物。本研究分為兩個部分：
　　第一部分：人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定。
　　目的：從嬰兒新鮮臍帶血中進(jìn)行內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離，并對其進(jìn)行科學(xué)的培養(yǎng)與鑒定。本文采用6％羥乙基淀粉沉降法和percoll非連續(xù)性密度梯度離心法，在新鮮人臍血中進(jìn)行內(nèi)皮

4、祖細(xì)胞（EPCs）分離，并將分離出的細(xì)胞純化，在體外進(jìn)行進(jìn)一步的培養(yǎng)和增殖。采用相關(guān)抗原免疫染色對所培養(yǎng)的人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行鑒定。以進(jìn)一步探尋簡化的實驗步驟，如何獲得足量內(nèi)皮祖細(xì)胞的最佳實驗方法，并為實驗課題提供充足、健康的內(nèi)皮祖細(xì)胞來源，為下一步實驗準(zhǔn)備充足的細(xì)胞來源。同時，深入探討人臍血中分離并大量培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞的可行性以及臨床應(yīng)用價值。
　　方法：收集蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科足月剖腹產(chǎn)手術(shù)胎兒臍帶血，無菌條件下放置于含

5、有50U/ml肝素的血清瓶中，放置于4℃冰盒中保存，運送至細(xì)胞培養(yǎng)室，采用密度梯度離心法來獲取臍帶血單個核細(xì)胞，將獲取的單個核細(xì)胞分成兩份，加入胎牛血清M199培養(yǎng)基（FCS-M199）及自體血清M199培養(yǎng)基（AS-M199），并分別將其接種于鋪設(shè)有人纖維連接蛋白（HFN）和未鋪設(shè)有人纖維連接蛋白的培養(yǎng)皿中（標(biāo)記為：F(0)、F(1)、A(0)、A(1)）進(jìn)一步進(jìn)行體外誘導(dǎo)、分化以及擴(kuò)增。并觀察貼壁細(xì)胞在整個誘導(dǎo)分化過程中的形態(tài)學(xué)變化

6、，結(jié)合免疫組化、免疫熒光以及流式細(xì)胞儀等相關(guān)技術(shù)從不同角度對其進(jìn)行鑒定。
　　結(jié)果：⑴培養(yǎng)1~2d后，臍血單個核細(xì)胞開始出現(xiàn)貼壁。而在3d之后紡錘形狀開始出現(xiàn)，此后貼壁細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，且逐漸變成梭形。當(dāng)培養(yǎng)至一周時，則形成周圍為梭形細(xì)胞，而在中央是圓形細(xì)胞的典型集落。而在細(xì)胞培養(yǎng)至14d時，則出現(xiàn)了互相連接的細(xì)胞簇逐漸連接并形成網(wǎng)樣結(jié)構(gòu)。與此同時，隨著培養(yǎng)時間的不斷增加，長梭形細(xì)胞也開始逐漸縮短，并呈典型鋪路石樣改變。⑵貼壁細(xì)胞

7、培養(yǎng)至一周之后繼續(xù)觀察，在鋪設(shè)有人纖維連接蛋白的培養(yǎng)基之內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量明顯較沒有鋪設(shè)人纖維連接蛋白的多，而在兩種不同培養(yǎng)基的細(xì)胞數(shù)量上無明顯變化。⑶免疫組化：單個核細(xì)胞培養(yǎng)至14d之后，貼壁細(xì)胞CD31通過FCS-M199培養(yǎng)后其陽性表達(dá)率為（88.95±7.23）%；vWF的陽性表達(dá)率為（75.01±9.42）%。AS-M199培養(yǎng)的細(xì)胞其CD31陽性表達(dá)率為(86.79±7.53)%，vWF的陽性表達(dá)率為(74.31±7.14)%。⑷

8、免疫熒光染色：細(xì)胞培養(yǎng)至第7d，細(xì)胞吞噬 DiI-acLDL（+），發(fā)出紅色熒光；結(jié)合 FITC-UEA-Ⅰ（+），發(fā)出綠色熒光；雙染（+）則呈黃色熒光。FCS-M199貼壁細(xì)胞雙染陽性率（86.56±6.81）%，AS-M199的貼壁細(xì)胞雙染陽性率（84.47±7.25）%。⑸流式細(xì)胞儀分析提示：第7天時所測定的貼壁細(xì)胞表面標(biāo)志 CD133、CD34以及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體-2(VEGFR-2)分別為：（29.35±6.43）%、

9、（52.79±8.01）%、（80.67±6.82）%；而在20天時的分析顯示CD133陽性率為(1.52±0.32)%，CD34以及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體-2(VEGFR-2)表達(dá)率則分別為（61.48±7.65）%、（91.28±7.98）%。
　　結(jié)論：①通過密度梯度離心法從臍帶血分離單個核細(xì)胞，再用 VEGF、bFGF等因子誘導(dǎo)培養(yǎng)，以 VEGFR-2、CD133及 CD34為標(biāo)志物進(jìn)行檢測，可獲得較為純化的血管內(nèi)皮祖細(xì)

10、胞。②加入人纖維連接蛋白之后可以有效促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞貼壁，其細(xì)胞貼壁數(shù)量明顯多于未加入人纖維連接蛋白組。③自體血清 M199培養(yǎng)基（AS-M199）可替代胎牛血清M199培養(yǎng)基（FCS-M199）培養(yǎng) EPCs，并取得較佳效果。④CD133在第7天時高度表達(dá)，在第20天時基本不表達(dá)，我們認(rèn)為此時血管內(nèi)皮祖細(xì)胞向成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變。因此，CD133可作為內(nèi)皮細(xì)胞與內(nèi)皮祖細(xì)胞相鑒別的重要標(biāo)志。
　　第二部分：改良凍融法脫細(xì)胞血管支架

11、的制備。
　　目的：改良傳統(tǒng)的凍融制備脫細(xì)胞血管支架的技術(shù)，并用組織學(xué)染色和電鏡觀察等方法分別對兩種不同方法制備的血管支架進(jìn)行比較。以進(jìn)一步尋找更安全有效的脫細(xì)胞的方法，找到一種操作簡便、滅菌效果確實、費用低廉、殘留低的脫細(xì)胞血管支架制備方法。簡化實驗步驟，并為血管組織工程實驗提供充足、健康的血管支架來源。
　　方法：集蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科足月剖腹產(chǎn)手術(shù)胎兒臍帶，無菌條件下放置于含有PBS液的血清瓶中，放置于4℃冰盒

12、中保存，運送至細(xì)胞培養(yǎng)室，剔除臍靜脈表面的結(jié)締組織及血管外膜，PBS液清洗后，按下列3種方法制備材料：(1)傳統(tǒng)方法：放置15 ml塑料凍存管內(nèi)，置4℃冰箱中預(yù)冷1小時，-80℃冰箱冷凍2h，37℃水浴復(fù)溫30min，上述凍融過程反復(fù)進(jìn)行3次。(2)改良方法：放置15 ml塑料凍存管內(nèi)，置4℃冰箱中預(yù)冷1小時，快速浸入-196℃液氮中20 min，取出標(biāo)本放入含50 ml無菌蒸餾水100 ml的無菌瓶內(nèi)，置于37℃的氣浴恒溫振蕩箱內(nèi)，反

13、復(fù)振蕩，融化30min；同法進(jìn)行3次，備檢測。(3)未處理：直接備檢測。
　　結(jié)果：⑴大體形態(tài)觀察：未處理組呈乳白色，管壁淡黃色，彈性良好無塌陷，管腔內(nèi)表面光滑。傳統(tǒng)反復(fù)凍融法組材料顏色淺白，管壁稍有塌陷，管腔內(nèi)表面光滑。改良反復(fù)凍融法組材料顏色淺白，管壁無明顯塌陷，管腔內(nèi)表面光滑。三者在大體形態(tài)上無明顯外觀上區(qū)別。⑵HE染色：HE染色、觀察，未脫細(xì)胞血管壁全層細(xì)胞豐富，管腔內(nèi)面內(nèi)皮細(xì)胞呈單層排列，中層平滑肌細(xì)胞胞體細(xì)長呈極性排列

14、。傳統(tǒng)反復(fù)凍融法處理后的血管材料內(nèi)皮細(xì)胞及中膜平滑肌細(xì)胞明顯變形，破碎；可見細(xì)胞核變形、濃染、碎裂等現(xiàn)象。改良反復(fù)凍融法處理后的血管材料管壁全層和管腔面無明顯細(xì)胞殘留。⑶Masson三色染色法：未處理組細(xì)胞豐富，膠原纖維結(jié)構(gòu)保持完整。傳統(tǒng)反復(fù)凍融組細(xì)胞仍有部分殘留。改良反復(fù)凍融組細(xì)胞成分大部分被脫去，藍(lán)染的膠原纖維結(jié)構(gòu)保持完整。⑷電鏡掃描結(jié)果：未處理組內(nèi)膜完整，光滑，內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋完整。傳統(tǒng)反復(fù)凍融處理組內(nèi)皮細(xì)胞斷裂，連續(xù)性中斷；內(nèi)膜下膠