糖基化修飾的臍血內(nèi)皮祖細胞在骨折模型中定向歸巢能力的研究.pdf

1、第一部分人臍血來源CD34內(nèi)皮祖細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及集落形成特性
　　目的：骨再生及修復中干細胞的應用是一種新興的治療策略。近年來內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells, EPCs）移植被認為是骨創(chuàng)傷及全身性骨疾?。ㄈ绻琴|(zhì)疏松、先天性的骨發(fā)育不全等）最具潛力的治療方法。但目前對EPCs的鑒定國內(nèi)外存有爭議，一種為形態(tài)上呈―紡錘樣‖的內(nèi)皮細胞集落形成單元（endothelial cell colon

2、y-forming units, CFU-ECs），另一種呈―鵝卵石樣‖的內(nèi)皮克隆形成細胞（endothelial colony-forming cells, ECFCs）。本研究擬分離、培養(yǎng)及鑒定人臍血來源的CFU-ECs與ECFCs，并對其進行鑒別界定和成血管能力研究，了解兩者的生物學差異。
　　方法：
　　1.收集健康新生產(chǎn)婦臍血，肝素抗凝，用等量的PBS稀釋，離心后取中間白膜層，用Easysep免疫磁珠（MACS）人

3、CD34細胞正選試劑篩選。
　　2.應用流式細胞術(shù)對比ECFCs和CFU-ECs兩種細胞表面抗原的表達差異性。
　　3.以EPCs的標志性基因為引物，應用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(Reverse transcription PCR, RT-PCR)技術(shù)對比兩種細胞基因水平差異。
　　4.應用細胞免疫熒光檢測兩種細胞表面標志分子蛋白水平的表達。
　　5.Dil-Ac-LDL攝取、集落形成及細胞成血管實驗等多種方法對比兩

4、類細胞功能方面的差異性。
　　結(jié)果：
　　通過流式檢測發(fā)現(xiàn) ECFCs和 CFU-ECs表達相同內(nèi)皮細胞表面抗原，如VEGER-2、CD31、CD144、CD105和CD146。而CD45和CD14在兩者的表達存在明顯差異，CFU-ECs表面強表達，ECFCs表面幾乎檢測不到?；蛩健⒌鞍姿揭沧C明上述結(jié)論。另外兩者在集落形態(tài)、細胞增殖能力、Dil-Ac-LDL攝取和體外成血管能力等方面均存在明顯差異；ECFCs可見多個散

5、在―鵝卵石樣‖集落形成，而CFU-ECs為梭形細胞排列呈放射狀，細胞功能方面ECFCs在攝食Dil-AC-LDL，成血管方面作用明顯，而CFU-ECs卻沒有這些細胞功能。
　　結(jié)論：
　　CFU-ECs可能是造血干細胞源性的細胞集落，并非真正的EPCs。而ECFCs具有很好的成血管能力，為真正意義上的 EPCs，在組織工程和臨床等方面有極大的應用前景。
　　第二部分重組巖藻糖級轉(zhuǎn)移酶VI過表達對內(nèi)皮祖細胞歸巢能力影響的

6、研究
　　目的：近年來研究發(fā)現(xiàn)EPCs在促進裸鼠骨折愈合及骨痂形成方面有顯著效果。EPCs用于骨折治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是其必須定向歸巢到缺血骨折區(qū)域，EPCs滾動、粘附、歸巢到損傷部位是由 P-選擇素(P-Selectin)和 E-選擇素(E-selectin)與其共同的配體 P-選擇素糖蛋白配體(P-selectin glycoprotein ligand-1, PSGL-1)的相互作用介導的；據(jù)Hidalgo發(fā)現(xiàn)干細胞的PSGL-1

7、不能有效地與P-Selectin和E-selectin結(jié)合，但細胞的體外糖基化可以明顯提高PSGL-1與選擇素的結(jié)合能力，如果通過糖基化修飾能夠修正EPCs的這一功能缺陷，將會大大提高EPCs的歸巢能力和骨疾病的治療價值。
　　方法：
　　1.用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將 pPROTA-TA為載體的人巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(a1-3fucosyl-transferase VI, FTVI)表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入EPCs。
　　2.轉(zhuǎn)染48 h后用流

8、式細胞儀檢測EPCs表面sLex結(jié)構(gòu)，驗證細胞表面糖基化效率。
　　3.采用流式細胞儀分析 EPCs、糖基化處理的 EPCs(fucosytransferase VI treated EPCs, FUT-EPCs)與P-Selectin的結(jié)合率。
　　4.在裸鼠股骨中段骨折模型中將PBS(contorl組)、EPCs（正常組）、FUT-EPCs（實驗組）分別注入骨折裸鼠尾靜脈；通過組織切片對比三組EPCs的歸巢能力。

9、　　結(jié)果：
　　1.流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染48 h后EPCs、FUT-EPCs的sLex結(jié)構(gòu)率，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染效率由未轉(zhuǎn)染前的4.8%上升到32%以上，且未發(fā)現(xiàn)明顯的細胞凋亡。
　　2.流式結(jié)果檢測EPCs、FUT-EPCs與P-Selectin的結(jié)合率；EPCs為5%，F(xiàn)UT-EPCs上升為19%。
　　3.裸鼠骨折局部軟組織切片；HE染色、免疫組化及組織免疫熒光結(jié)果顯示，骨折區(qū)域的血管腔及內(nèi)皮可見人EPCs的特異標志蛋白