經(jīng)HCMV感染的人臍血造血干細(xì)胞向淋巴系祖細(xì)胞增殖過(guò)程中Hoxb4、Hoxb6基因的表達(dá).pdf

1、目的：探討經(jīng)人類巨細(xì)胞病毒(Human Cytomegalovirus，HCMV)感染的人臍血造血干細(xì)胞(Hematopoietic Stem Cell，HSC)向淋巴系造血祖細(xì)胞(或稱淋巴細(xì)胞集落生成單位，Colony Forming Unit-T Lymphocyte，CFU-TL)增殖分化過(guò)程中同源盒(homeobox，hox)b4基因(hoxb4 gene)、hoxb6基因(hoxb6 gene)表達(dá)的情況，以及用HCMV和/或

2、全反式維甲酸(all-trans-retinoic acid，ATRA)對(duì)其進(jìn)行干擾后，采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(fluorogenic quantitive reverse transcription polymerize chain reaction，F(xiàn)Q-RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)其hoxb4、hoxb6基因信使核糖核酸(messenger-ribonucleic acid，mRNA)的表達(dá)情況，從而探討HCMV、ATRA在

3、此過(guò)程中對(duì)hoxb4、hoxb6基因表達(dá)的影響，在基因水平探討HCMV感染導(dǎo)致臍血淋巴系祖細(xì)胞損傷的機(jī)制。 方法：1．取正常健康母親正常足月順產(chǎn)兒斷臍后的胎盤段臍血。2．實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)分4組：(1)空白對(duì)照組(BLANK組)：正常培養(yǎng)體系，不加予任何處理因素。(2)HCMV組：僅以人巨細(xì)胞病毒-AD169(Human cytomegalovirus—AD169，HCMV-AD169)病毒液按105蝕斑形成單位(plaque fo

4、rmation unit，pFU)/ml 0.1ml感染正常培養(yǎng)體系。(3)HCMV+ATRA組：同時(shí)加入HCMV-AD169病毒液0.1ml及ATRA 0.1ml，終濃度為6×10-8mol/l。(4)ATRA組：僅在正常培養(yǎng)體系中加入ATRA 0.1ml，終濃度同上。3．采用造血祖細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)，以HCMV-AD169和(或)ATRA持續(xù)干擾人類造血干細(xì)胞，觀察不同時(shí)間點(diǎn)各組的人類造血干祖細(xì)胞經(jīng)植物血凝素(Phytohemaggl

5、utinin M，PHA-M)誘導(dǎo)后的淋巴系祖細(xì)胞集落生成情況。4．采用瑞-姬染色法鑒定CFU-TL集落細(xì)胞成分。5．在不同時(shí)間點(diǎn)即第3天、第7天、第12天分別提取各組細(xì)胞核糖核酸(ribonucleicacid，RNA)，用1％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA分子的完整性。6．將抽提到的各時(shí)間點(diǎn)，不同分組細(xì)胞通過(guò)隨機(jī)引物將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)脫氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid，cDNA

6、)，采用FQ-RT-PCR技術(shù)檢測(cè)臍血淋巴系祖細(xì)胞增殖分化過(guò)程中各組hoxb4、hoxb6基因的表達(dá)。7．通過(guò)RNA電泳分別獲得各組hoxb4、hoxb6在3天、7天、12天RNA電泳圖并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。8．?dāng)?shù)據(jù)處理：以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差(-x±S)表示hoxb4、hoxb6基因的變化情況進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，TWO-WAY方差分析，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義后組間均數(shù)兩兩比較(LSD法)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有統(tǒng)計(jì)工作均由統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 15.0 for

7、 Windows完成。 結(jié)果：1．集落細(xì)胞的形態(tài)學(xué)鑒定，瑞-姬染色法證明所培養(yǎng)的是淋巴系祖細(xì)胞。 2．1％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳顯示RNA電泳圖的5s,18s,28s三條帶型整齊，無(wú)明顯拖尾及彌散，說(shuō)明RNA結(jié)構(gòu)基本完整，無(wú)明顯降解。3．逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增各組均有目的基因hoxb4、hoxb6和內(nèi)參照人磷酸甘油醛脫氫酶(gluceraldehyde phospha

8、tedehydrogenase，gapdh)基因的cDNA的產(chǎn)物，與DNA分子Marker相比示擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為：hoxb4為138個(gè)堿基對(duì)(base pair，bp)，hoxb6為119 bp，gapdh基因?yàn)?41 bp，與預(yù)定理論值大小符合。4．人臍血造血干細(xì)胞向淋巴系造血祖細(xì)胞增殖分化過(guò)程中(體外)，各組的hoxb4、hoxb6基因均有表達(dá)，且隨時(shí)間推移，hoxb4基因的相對(duì)表達(dá)量逐漸降低；而hoxb6基因的相對(duì)表達(dá)量在增殖分

9、化的第7天最高，第12天降低。5．與BLANK組比較，ATRA組的hoxb4、hoxb6基因相對(duì)表達(dá)量較BLANK組顯著為高，而HCMV組的hoxb4、hoxb6基因相對(duì)表達(dá)量較BLANK組為低。6．與HCMV組比較，HCMV+ATRA組的hoxb4、hoxb6基因的相對(duì)表達(dá)量較HCMV組為高。 結(jié)論：1．Hoxb4、hoxb6基因在臍血淋巴系祖細(xì)胞中(體外)均有表達(dá)，與淋巴系造血呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。2．人臍血造血干細(xì)胞向淋巴系造

10、血祖細(xì)胞增殖分化過(guò)程中(體外)，隨時(shí)間推移，hoxb4基因表達(dá)逐漸減弱。3．在人臍血造血干細(xì)胞向淋巴系造血祖細(xì)胞增殖分化過(guò)程中(體外)，隨時(shí)間推移，hoxb6基因表達(dá)在增殖分化的第7天表達(dá)較強(qiáng)烈，第12天表達(dá)減弱。4．HCMV能下調(diào)淋巴系祖細(xì)胞hoxb4、hoxb6基因的表達(dá)(體外)，提示HCMV可能通過(guò)調(diào)控hoxb4、hoxb6基因表達(dá)異常引起造血功能異常。5．ATRA不僅能顯著上調(diào)正常淋巴系祖細(xì)胞hoxb4、hoxb6基因的表達(dá)，而