G-CSF對心房、心室心肌細(xì)胞增殖的影響及p38 MAPK活性研究.pdf

1、急性心肌梗死(acutemyocardialinfartion,AMI)是嚴(yán)重危害人類健康的心血管疾病。過量的功能心肌細(xì)胞丟失是影響其預(yù)后的主要因素。以往認(rèn)為心肌細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，近年研究發(fā)現(xiàn)，正常和病理狀態(tài)下有增殖分裂的心肌細(xì)胞亞群【H】。另外，成體心肌中存在具心臟干細(xì)胞特征的亞群體(Lin-c-kit+細(xì)胞)，它能夠自我更新，克隆復(fù)制，多潛能分化，體內(nèi)參與功能性心肌的新生[5-91。因此，理想的AMI治療策略應(yīng)能使心肌和血管再生，

2、重建心功能。 基礎(chǔ)研究和初步臨床試驗證明，AMI后粒系集落刺激因子(granulocytecolony-stimulatingfactor，G-CSF)治療，能夠新生血管和心肌，促進(jìn)修復(fù)過程，逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)，改善心功能110-1刀。G-CSF為AMI提供了有效的非侵入性的再生治療新手段。G-CSF治療心梗的益處，不僅是由于動員骨髓干細(xì)胞歸巢至梗死區(qū)，而且也歸因于G-CSF對損傷心肌的直接作用(抗凋亡效應(yīng))【16-17】。

3、Peter等[18]以DsRed標(biāo)記骨髓干細(xì)胞，證實梗死后G-CSF治療能夠增加成心肌細(xì)胞系數(shù)目，但新生細(xì)胞并非骨髓來源而是心肌源性。那么G-CSF是否直接作用于心臟干細(xì)胞，促進(jìn)其向心肌細(xì)胞的增殖分化?考慮到G-CSF對心肌細(xì)胞直接作用并有促其他細(xì)胞增殖的作用，除抗凋亡外，它是否有直接促進(jìn)心肌細(xì)胞分裂效應(yīng)?由于心臟干細(xì)胞主要分布于心房中，心房、心室的心肌細(xì)胞增殖狀態(tài)是否存在著差異?由于p38MAPK信號傳導(dǎo)途徑在心肌細(xì)胞的增殖、凋亡和分

4、化中起重要調(diào)控作用，G-CSF對心肌細(xì)胞的直接作用是否涉及p38MAPK活性的改變? 本課題首先觀察了G-CSF對于不同部位(心房、心室)心肌細(xì)胞增殖的影響，同時對照比較心房心室肌細(xì)胞增殖有無差異，然后檢測p38MAPK活性是否變化，初步探討G-CSF對心肌細(xì)胞的直接作用及與p38MAPK信號通路的關(guān)系。 第一部分G-CSF對乳鼠心房、心室心肌細(xì)胞增殖的影響 目的：觀察心房、心室心肌細(xì)胞增殖有無差異及G-CSF是

5、否有促進(jìn)乳鼠心肌細(xì)胞增殖的作用。 方法：SD乳鼠心房、心室原代心肌細(xì)胞經(jīng)10％FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后，加入干預(yù)因素并分別于加入干預(yù)因素后24h和72h兩個時間點觀察細(xì)胞增殖指標(biāo)。培養(yǎng)36h后更換為0．2％FBS的DMEM培養(yǎng)液。實驗設(shè)2個大組：心房組、心室組。每大組分為2亞組：A．空白對照組。B．G-CSF組。G-CSF終濃度為100ng/ml。每亞組重復(fù)3孔。以Brdu摻入測定DNA合成作為細(xì)胞增殖指標(biāo)。

6、結(jié)果：1)心房+G-CSF組、心房對照組Brdu摻入指數(shù)均顯著高于相應(yīng)的心室+G-CSF組、心室對照組(P<0．05)。 2)在加入干預(yù)因素兩個時間點(24h、72h)上，G-CSF組BrdU摻入指數(shù)相對于對照組無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P>O．05)。但是，72h時心房+G-CSF組相對于對照組BrdU摻入率增高，有統(tǒng)計學(xué)趨勢(P=O．12)。 結(jié)論：乳鼠心房肌細(xì)胞較心室肌細(xì)胞，處于相對活躍的增殖狀態(tài)。G-CSF對心肌細(xì)胞增殖

7、分裂無顯著影響，提示G-CSF對心肌細(xì)胞的直接作用體現(xiàn)為抗凋亡，而非促細(xì)胞增殖。 第二部分G-CSF干預(yù)下乳鼠心房、心室心肌細(xì)胞的p-38MAPK活性研究 目的：觀察血清饑餓狀態(tài)下心房、心室心肌細(xì)胞p38MAPK蛋白活性有無差異及在G-CSF干預(yù)下p38MAPK的活性變化。 方法：SD乳鼠心房、心室原代心肌細(xì)胞原代心肌細(xì)胞經(jīng)l0％FBS的DMEM培養(yǎng)液靜置培養(yǎng)24h后加入干預(yù)因素，培養(yǎng)36h后更換為0．2％FBS

8、的DMEM培養(yǎng)液，饑餓2天后westernblot法測定磷酸化p38MAPK蛋白的表達(dá)。實驗設(shè)2個大組：心房組、心室組。每大組分為2亞組：A．空白對照組。B．G-CSF組。G-CSF終濃度為100ng/ml。實驗重復(fù)3次。 結(jié)果：(1)饑餓2天后心房肌細(xì)胞p38MAPK活性顯著低于心室肌細(xì)胞(P<0．05)。 (2)G-CSF干預(yù)下，心室肌細(xì)胞Phospho-p38MAPK蛋白的表達(dá)顯著降低(P<0．05)；心房肌細(xì)胞P