利拉魯肽對(duì)高糖條件下SD乳鼠心肌細(xì)胞P38MAPK信號(hào)通路作用的研究.pdf

1、目的:糖尿病性心肌病(DCM)作為糖尿病獨(dú)立的心血管并發(fā)癥日益受到重視。心肌細(xì)胞凋亡在糖尿病心肌病的形成中起到重要作用，最終發(fā)展為充血性心功能衰竭。目前還沒(méi)有措施能夠阻止糖尿病心肌病的形成和進(jìn)展。胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)是由腸道內(nèi)分泌細(xì)胞L細(xì)胞分泌的一種重要的腸促胰島素，GLP-1類(lèi)似物-利拉魯肽作為降糖藥物已廣泛的應(yīng)用于臨床，其胰腺外作用特別是對(duì)心肌細(xì)胞的作用是目前糖尿病領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)旨在探討GLP-1類(lèi)似物利拉魯肽對(duì)

2、SD乳鼠心肌細(xì)胞在高糖條件下的作用及其可能的機(jī)制。
　　方法:
　　1、SD乳鼠心肌細(xì)胞的提取:取1-3天齡的健康SD(SpragueDawley)大鼠乳鼠20只，處死后取心尖，應(yīng)用胰酶及Ⅱ型膠原酶消化法提取細(xì)胞，通過(guò)差速貼壁法純化心肌細(xì)胞，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)后換液繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，此時(shí)可觀察到心肌細(xì)胞貼壁良好且偽足相互接觸交織成網(wǎng)并呈現(xiàn)同步搏動(dòng)，通過(guò)倒置相差顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察以及熒光法進(jìn)行鑒定。
　　2、分組干

3、預(yù):將培養(yǎng)72小時(shí)的心肌細(xì)胞分7組分別為正常糖組(5.5mmol/L葡萄糖)、高滲對(duì)照組(5.5mmol/L葡萄糖+19.5mmol/L甘露醇)、高糖對(duì)照組（25.0mmol/L葡萄糖）、高糖+低濃度利拉魯肽組（25.0mmol/L葡萄糖+50nmol/L利拉魯肽）、高糖+中濃度利拉魯肽組（25.0mmol/L葡萄糖+100nmol/L利拉魯肽）、高糖+高濃度利拉魯肽組（25.0mmol/L葡萄糖+200nmol/L利拉魯肽）、正常糖+

4、高濃度利拉魯肽組(5.5mmol/L葡萄糖+200nmol/L利拉魯肽)。將7組細(xì)胞在不含胎牛血清的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)進(jìn)行以下操作(48小時(shí)換液)。
　　3、細(xì)胞凋亡檢測(cè):將7組細(xì)胞干預(yù)72小時(shí)后酒精固定，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
　　4、蛋白表達(dá)的測(cè)定:將7組細(xì)胞干預(yù)72小時(shí)后提取蛋白，用Westernblot檢測(cè)凋亡蛋白caspase-3及P-P38MAPK/P38MAPK。
　　5、數(shù)據(jù)分析:所得數(shù)據(jù)采

5、用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，統(tǒng)計(jì)分析運(yùn)用SPSS13.0軟件。多個(gè)樣本均數(shù)間的比較用方差分析(One-wayANOVA)，均數(shù)間的兩兩比較用q檢驗(yàn)。P＜0.05為有意義;P＜0.01為有顯著意義。
　　結(jié)果:
　　1、一般指標(biāo)觀察:與低糖對(duì)照組心肌細(xì)胞相比，高糖對(duì)照組心肌細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較差，搏動(dòng)減弱，利拉魯肽干預(yù)組介于正常糖組及高糖組之間，高滲組及正常糖+高濃度利拉魯肽組同對(duì)照組無(wú)明顯差別。
　　2、凋亡率:高糖對(duì)照組

6、較正常糖組心肌細(xì)胞凋亡率明顯增加(19.39±1.37％vs3.33±0.32％，P＜0.01)，利拉魯肽干預(yù)組較高糖組比較凋亡率均有明顯降低（P＜0.01），但均高于正常糖組(P＜0.01)，高糖+高濃度利拉魯肽組凋亡率低于高糖+低、中濃度利拉魯肽組(7.11±1.42％vs12.02±0.88、11.27±1.93，P＜0.05)，但低、中濃度的利拉魯肽組凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，高滲組及正常糖+高濃度利拉魯肽組同正常

7、糖組比較凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(3.29±0.48、2.88±0.98vs3.33±0.32，P＞0.05)。
　　3、Westernblot結(jié)果:
　　3.1半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）的表達(dá):高糖組較對(duì)正常糖組心肌細(xì)胞caspase-3表達(dá)明顯增加(P＜0.01)，高糖+利拉魯肽干預(yù)組caspase-3的表達(dá)介于對(duì)照組及高糖組之間(P＜0.01)，并與利拉魯肽濃度負(fù)相關(guān)，高濃度利拉魯肽組caspase

8、-3的表達(dá)低于低、中濃度利拉魯肽組(P＜0.01)，但低、中濃度的利拉魯肽組caspase-3表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，高滲組及正常糖+高濃度利拉魯肽組同正常糖組比較caspase-3表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3.2磷酸化P38MAPK的表達(dá):高糖組較對(duì)正常糖組心肌細(xì)胞磷酸化P38MAPK(P-p38MAPK)表達(dá)明顯增加(P＜0.01)，高糖+利拉魯肽干預(yù)組P-p38MAPK的表達(dá)介于對(duì)照組及高糖組

9、之間(P＜0.01)，同樣與利拉魯肽濃度負(fù)相關(guān)，高濃度利拉魯肽組P-p38MAPK的表達(dá)低于低、中濃度利拉魯肽組，但低、中濃度的利拉魯肽組凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，高滲組及低糖+高濃度利拉魯肽組同正常糖組比較P-p38MAPK表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、高糖能促進(jìn)SD乳鼠的心肌細(xì)胞凋亡的增加，利拉魯肽可以對(duì)抗心肌細(xì)胞凋亡。
　　2、利拉魯肽干預(yù)組較高糖組的caspase-3