降鈣素基因相關(guān)肽對(duì)低糖-高糖孵育乳鼠心肌細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷的影響.pdf

1、目的：
　　探討降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）后處理對(duì)低糖/高糖孵育乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧（H/R）損傷的影響，并探討CGRP的保護(hù)機(jī)制。
　　方法：
　　1．心肌細(xì)胞培養(yǎng)、鑒定方法及建立H/R模型。選取健康出生72小時(shí)以內(nèi)的SD大鼠，取出并剪碎心臟，Ⅱ型膠原酶反復(fù)消化數(shù)次，離心后取上清接種于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)72小時(shí)。對(duì)心肌細(xì)胞特有的橫紋肌肌動(dòng)蛋白使用免疫組化SABC法對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行鑒定。培養(yǎng)72小時(shí)后，心肌細(xì)胞缺氧3

2、小時(shí)復(fù)氧2小時(shí)，缺氧/復(fù)氧結(jié)束之后使用TUNEL法測(cè)定各孔心肌細(xì)胞的凋亡率。
　　2．CGRP對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞H/R損傷的影響。將培養(yǎng)72小時(shí)的心肌細(xì)胞選取12孔細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并隨機(jī)分成四組（n=3）:①對(duì)照組：不處理不加藥；②H/R組：更換缺氧液缺氧3小時(shí)，更換DMEM復(fù)氧2小時(shí)；③H/R+CGRP組：更換缺氧液缺氧3小時(shí)，更換含有10-8mmol/L CGRP的DMEM，復(fù)氧2小時(shí)；④H/R+CGRP+CGRP8-37組：提前1小

3、時(shí)更換含有10-7mmol/L的CGRP8-37的DMEM，更換缺氧液缺氧3小時(shí)，更換含有10-8mmol/L的CGRP的DMEM，復(fù)氧2小時(shí)。將四組心肌細(xì)胞按照以上方法處理后，使用TUNEL法測(cè)定各孔心肌細(xì)胞的凋亡率；收集上清液，ELISA法測(cè)定各孔心肌細(xì)胞培養(yǎng)基中的乳酸脫氫酶（LDH）及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）的濃度。
　　3．CGRP對(duì)原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞H/R損傷保護(hù)的機(jī)制。按照方法2進(jìn)行分組及處理，

4、使用JC-1測(cè)定心肌細(xì)胞線粒體膜電位（MMP）變化，使用Fluo-3 AM和Rhod-2 AM分別測(cè)定細(xì)胞內(nèi)及線粒體內(nèi)的鈣濃度，使用DCFH-DA測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的活性氧濃度。4．CGRP對(duì)高糖孵育心肌細(xì)胞H/R損傷的影響。心肌細(xì)胞分別用低糖DMEM及高糖 DMEM孵育，將培養(yǎng)72小時(shí)的心肌細(xì)胞選取15孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并隨機(jī)分成5組（n=3）:①低糖對(duì)照組（LG）：心肌細(xì)胞全程使用低糖 DMEM孵育，不進(jìn)行缺氧/復(fù)氧的處理，不更換缺氧液，也不添加任

5、何藥物的干預(yù)；②高糖對(duì)照組（HG）：心肌細(xì)胞全程使用高糖DMEM孵育，不進(jìn)行缺氧/復(fù)氧的處理，不更換缺氧液，也不添加任何藥物的干預(yù)；③高糖缺氧/復(fù)氧組（HG+H/R）:心肌細(xì)胞全程使用高糖 DMEM孵育，心肌細(xì)胞缺氧3小時(shí)復(fù)氧2小時(shí)，不添加任何藥物的干預(yù)；④HG+H/R+CGRP組：心肌細(xì)胞全程使用高糖DMEM孵育，心肌細(xì)胞缺氧3小時(shí)復(fù)氧2小時(shí)，在缺氧結(jié)束后復(fù)氧開始前更換 DMEM時(shí)加入 CGRP（10-8mmol/L）；⑤HG+H/R

6、+CGRP+CGRP8-37組：心肌細(xì)胞全程使用高糖DMEM孵育，提前1小時(shí)加入CGRP8-37（10-7mmol/L），缺氧3小時(shí)，更換DMEM時(shí)加CGRP（10-8mmol/L）復(fù)氧2小時(shí)。將五組心肌細(xì)胞按照以上方法處理后，使用TUNEL法測(cè)定各孔心肌細(xì)胞的凋亡率；收集上清液，ELISA法測(cè)定各孔心肌細(xì)胞培養(yǎng)基中的乳酸脫氫酶（LDH）及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）的濃度。
　　5．CGRP對(duì)高糖孵育乳鼠心肌細(xì)

7、胞缺氧/復(fù)氧損傷保護(hù)的機(jī)制。按照方法4進(jìn)行分組及處理，使用Fluo-3 AM和Rhod-2 AM分別測(cè)定細(xì)胞內(nèi)及線粒體內(nèi)的鈣濃度，使用DCFH-DA測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的活性氧濃度。
　　結(jié)果：
　　1．心肌細(xì)胞培養(yǎng)成功，在顯微鏡下觀察、拍照并計(jì)數(shù)，所需心肌細(xì)胞的數(shù)量占所有細(xì)胞數(shù)量總和的90％以上。
　　2．成功建立H/R損傷，凋亡率明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。
　　3．H/R組心肌細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞內(nèi)活性氧濃度、細(xì)胞及

8、線粒體內(nèi)的鈣濃度、培養(yǎng)基中LDH和caspase-3的濃度比對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，MMP明顯下降（P<0.05）；通過與 H/R組的對(duì)比，觀察 H/R+CGRP組心肌細(xì)胞的凋亡率、培養(yǎng)基中 LDH和caspase-3的濃度、細(xì)胞內(nèi)的活性氧濃度、細(xì)胞內(nèi)及線粒體內(nèi)的鈣濃度均明顯下降(P<0.05)，MMP明顯升高（P<0.05）；并且CGRP的特異性拮抗劑CGRP8-37可以逆轉(zhuǎn)CGRP對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的作用。
　　4．

9、與LG組比較，HG組心肌細(xì)胞凋亡率、培養(yǎng)基中LDH和caspase-3的濃度、細(xì)胞內(nèi)活性氧濃度、細(xì)胞內(nèi)及線粒體內(nèi)的鈣濃度均明顯升高(P<0.05)；與HG組比較， HG+ H/R組心肌細(xì)胞凋亡率、培養(yǎng)基中LDH和caspase-3的濃度、細(xì)胞內(nèi)活性氧濃度、細(xì)胞及線粒體內(nèi)的鈣濃度均明顯升高(P<0.05)；與 HG+H/R組比較， HG+H/R+CGRP組心肌細(xì)胞的凋亡率、培養(yǎng)基中LDH和caspase-3的濃度、細(xì)胞內(nèi)活性氧濃度、細(xì)胞及

10、線粒體內(nèi)的鈣濃度均明顯下降(P<0.05)；并且CGRP的特異性拮抗劑CGRP8-37可以逆轉(zhuǎn)CGRP對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的作用。
　　結(jié)論：
　　1．心肌細(xì)胞經(jīng)過H/R處理后導(dǎo)致細(xì)胞損傷，CGRP后處理可以減輕H/R對(duì)心肌細(xì)胞的損傷，CGRP8-37可以逆轉(zhuǎn)CGRP的作用。
　　2．高糖 DMEM孵育對(duì)心肌細(xì)胞造成了損傷，缺氧/復(fù)氧可以加重高糖孵育心肌細(xì)胞的損傷，CGRP后處理可以減輕高糖孵育心肌細(xì)胞的缺氧/復(fù)氧損傷