miR-27a介導(dǎo)利拉魯肽抑制H9C2大鼠心肌細(xì)胞纖維化作用的研究.pdf

1、目的：
　　糖尿病患病率逐年增加，據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會最新數(shù)據(jù)顯示2015年全世界有4.15億20-79歲之間的糖尿病患者，而到2040年這一數(shù)字將上升到6.42億。糖尿病是一種全身性疾病，繼發(fā)于糖尿病的心血管并發(fā)癥發(fā)病率高，其中心肌纖維化是導(dǎo)致糖尿病患者心室重構(gòu)的重要原因。心肌纖維化目前尚無有效的治療方法，所以預(yù)防及控制其進(jìn)展尤為重要。利拉魯肽屬于 GLP-1受體激動劑，除降糖作用外還有減重、調(diào)脂及心血管保護(hù)等作用。近期研究顯示利

2、拉魯肽還具有抗纖維化作用，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)利拉魯肽具有減輕糖尿病大鼠心肌及肺組織纖維化的作用，在 H9C2大鼠心肌細(xì)胞中利拉魯肽可降低 MicroRNA27a(miR-27a)表達(dá)。MicroRNAs(miRNAs)是轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一類非編碼小RNAs，在細(xì)胞及生長過程中有重要的調(diào)節(jié)作用，并與人類和動物的多種疾病有關(guān)。近年研究發(fā)現(xiàn) miR-27a在肝、肺等許多器官中具有促纖維化作用，并與心力衰竭及心肌肥大有關(guān)。本研究旨在體外

3、觀察miR-27a表達(dá)對H9C2大鼠心肌細(xì)胞纖維化的影響，高糖狀態(tài)下心肌細(xì)胞 miR-27a表達(dá)變化及利拉魯肽是否通過降低miR-27a表達(dá)抑制H9C2大鼠心肌細(xì)胞纖維化，從而為心肌纖維化預(yù)防及控制提供新靶點(diǎn)。
　　方法：
　　1.將H9C2大鼠心肌細(xì)胞分為6組：對照組，脂質(zhì)體lipo2000組（lipo2000組），轉(zhuǎn)染miR-27a mimics低濃度組（miR-27a mimics低濃度組），轉(zhuǎn)染miR-27a mim

4、ics低濃度陰性對照組（miR-27a mimics低濃度N.C組），轉(zhuǎn)染miR-27a mimics高濃度組（miR-27a mimics高濃度組），轉(zhuǎn)染miR-27a mimics高濃度陰性對照組（miR-27a mimics高濃度N.C組），其中低濃度組分別轉(zhuǎn)染miR-27a mimics及N.C各150 pmol，高濃度組分別轉(zhuǎn)染miR-27a mimics及N.C各300 pmol，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。
　　2.將

5、H9C2大鼠心肌細(xì)胞分為8組：低糖組(LG組)，高糖組(HG組)，高糖+miR-27a mimics組(mimics組)，高糖+miR-27a inhibitor組(inhibitor組)，高糖+miR-27a mimics N.C組(mimics N.C組)，高糖+miR-27a inhibitor N.C組(inhibitor N.C組)，高糖+ lipo2000組(lipo組)，高滲組(HO組)。 miR-27a mimics及N

6、.C和miR-27a inhibitor及N.C轉(zhuǎn)染濃度為300 pmol，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。目的：
　　糖尿病患病率逐年增加，據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會最新數(shù)據(jù)顯示2015年全世界有4.15億20-79歲之間的糖尿病患者，而到2040年這一數(shù)字將上升到6.42億。糖尿病是一種全身性疾病，繼發(fā)于糖尿病的心血管并發(fā)癥發(fā)病率高，其中心肌纖維化是導(dǎo)致糖尿病患者心室重構(gòu)的重要原因。心肌纖維化目前尚無有效的治療方法，所以預(yù)防及控制其進(jìn)展尤為重

7、要。利拉魯肽屬于 GLP-1受體激動劑，除降糖作用外還有減重、調(diào)脂及心血管保護(hù)等作用。近期研究顯示利拉魯肽還具有抗纖維化作用，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)利拉魯肽具有減輕糖尿病大鼠心肌及肺組織纖維化的作用，在 H9C2大鼠心肌細(xì)胞中利拉魯肽可降低 MicroRNA27a(miR-27a)表達(dá)。MicroRNAs(miRNAs)是轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一類非編碼小RNAs，在細(xì)胞及生長過程中有重要的調(diào)節(jié)作用，并與人類和動物的多種疾病有關(guān)。近年研究

8、發(fā)現(xiàn) miR-27a在肝、肺等許多器官中具有促纖維化作用，并與心力衰竭及心肌肥大有關(guān)。本研究旨在體外觀察miR-27a表達(dá)對H9C2大鼠心肌細(xì)胞纖維化的影響，高糖狀態(tài)下心肌細(xì)胞 miR-27a表達(dá)變化及利拉魯肽是否通過降低miR-27a表達(dá)抑制H9C2大鼠心肌細(xì)胞纖維化，從而為心肌纖維化預(yù)防及控制提供新靶點(diǎn)。
　　方法：
　　1.將H9C2大鼠心肌細(xì)胞分為6組：對照組，脂質(zhì)體lipo2000組（lipo2000組），轉(zhuǎn)染mi

9、R-27a mimics低濃度組（miR-27a mimics低濃度組），轉(zhuǎn)染miR-27a mimics低濃度陰性對照組（miR-27a mimics低濃度N.C組），轉(zhuǎn)染miR-27a mimics高濃度組（miR-27a mimics高濃度組），轉(zhuǎn)染miR-27a mimics高濃度陰性對照組（miR-27a mimics高濃度N.C組），其中低濃度組分別轉(zhuǎn)染miR-27a mimics及N.C各150 pmol，高濃度組分別轉(zhuǎn)染

10、miR-27a mimics及N.C各300 pmol，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。
　　2.將 H9C2大鼠心肌細(xì)胞分為8組：低糖組(LG組)，高糖組(HG組)，高糖+miR-27a mimics組(mimics組)，高糖+miR-27a inhibitor組(inhibitor組)，高糖+miR-27a mimics N.C組(mimics N.C組)，高糖+miR-27a inhibitor N.C組(inhibitor N.C

11、組)，高糖+ lipo2000組(lipo組)，高滲組(HO組)。 miR-27a mimics及N.C和miR-27a inhibitor及N.C轉(zhuǎn)染濃度為300 pmol，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。
　　3.將 H9C2大鼠心肌細(xì)胞分為6組：對照組，利拉魯肽組，利拉魯肽+lipo2000組，利拉魯肽+miR-27a mimics組，利拉魯肽+miR-27a mimics N.C組，miR-27a mimics組。其中miR-27

12、a mimics及N.C轉(zhuǎn)染濃度為300 pmol，利拉魯肽濃度為1000 nmol/L(1000 nM)，含利拉魯肽組于轉(zhuǎn)染前24小時(shí)給予1000 nM利拉魯肽提前干預(yù)，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。
　　收集細(xì)胞后用熒光定量PCR檢測各組miR-27a表達(dá)水平，細(xì)胞免疫熒光染色觀察細(xì)胞內(nèi)膠原蛋白I表達(dá)情況。用Western Blotting方法檢測與心肌纖維化相關(guān)因子：過氧化酶活化增值受γ(PPARγ)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-

13、β1)、結(jié)締組織生長因子（CTGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1.熒光定量 PCR結(jié)果顯示 miR-27a mimics低濃度組及高濃度組較對照組miR-27a表達(dá)水平增高，且高濃度組較低濃度組miR-27a表達(dá)水平進(jìn)一步增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＜0.05）。對照組與lipo2000組、miR-27a mimics低濃度N.C組和高濃度N.C組miR-27a表達(dá)水平無差異。
　　2.熒

14、光定量PCR結(jié)果示高糖組較低糖組miR-27a表達(dá)水平增高，高糖+miR-27a mimics組增高更顯著（p＜0.05）。而高糖+miR-27a inhibitor組較低糖組miR-27a表達(dá)水平降低（p＜0.05）。高糖組與高糖+lipo2000組，高糖+miR-27a mimics N.C組，高糖+miR-27a inhibitor N.C組miR-27a表達(dá)水平無差異，低糖組與高滲組miR-27a表達(dá)水平無差異。
　　3.

15、 Western Blotting結(jié)果顯示，高糖組和高糖+miR-27a mimics較低糖組PPARγ蛋白表達(dá)水平降低，TGF-β1、MMP-9和 CTGF蛋白表達(dá)水平增高，且高糖+miR-27a mimics組蛋白表達(dá)變化更顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。高糖+miR-27a inhibitor組較低糖組蛋白表達(dá)呈反向變化（p＜0.05）。高糖組與高糖+lipo2000組，高糖+miR-27a mimics N.C組，高糖+

16、miR-27a inhibitor N.C組蛋白表達(dá)水平無差異，低糖組與高滲組蛋白表達(dá)水平無差異。
　　4.用利拉魯肽1000 nM提前干預(yù)后，利拉魯肽組、利拉魯肽+lipo2000組及利拉魯肽+miR-27a mimics N.C組miR-27a表達(dá)水平較對照組下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＜0.05）。利拉魯肽+miR-27a mimics組與miR-27a mimics組miR-27a表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但較其余四組明顯增加（p＜

17、0.05）。
　　5.細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果示細(xì)胞內(nèi)膠原蛋白 I表達(dá)水平與細(xì)胞內(nèi) miR-27a表達(dá)水平一致，隨著細(xì)胞內(nèi)miR-27a表達(dá)水平增加，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增加。
　　結(jié)論：
　　1. miR-27a可促進(jìn)心肌細(xì)胞纖維化并呈濃度依賴性。
　　2.高糖狀態(tài)下心肌細(xì)胞miR-27a表達(dá)增加，miR-27a可調(diào)節(jié)PPARγ、TGF-β1、MMP-9和 CTGF蛋白表達(dá)促進(jìn)心肌細(xì)胞纖維化。
　　3.利拉魯肽能降