CyclinA2對心肌細胞缺氧的影響.pdf

1、背景：心血管疾病已成為全球健康所關(guān)注的焦點，其中最為常見的是心肌梗死，目前對該病的治療方法很不確定，通過基因?qū)隒yclinA2的表達方法可使心肌細胞周期分化激活，并可增加臨界區(qū)的肌絲密度，提高心肌功能。CyclinA2基因?qū)敕赏蔀橐环N高效的治療心肌梗死的方法。
　　 目的：制作心肌細胞缺氧模型，探討心肌細胞轉(zhuǎn)染CyclinA2后對心肌細胞缺氧的作用。
　　 方法：
　　 1.細胞培養(yǎng)
　　 (1)

2、取1～3 d SD大鼠12只，取心室肌組織分別消化、離心、標(biāo)記后，分別在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(2)將培養(yǎng)的心肌細胞4％多聚甲醛固定后分別行常規(guī)細胞免疫組化染色鑒定。
　　 2.腺病毒轉(zhuǎn)染
　　 (1)待細胞培養(yǎng)到36h，將cyclinA2腺病毒和空載體病毒轉(zhuǎn)染至細胞內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)12h。(2)將轉(zhuǎn)染病毒后的細胞培養(yǎng)12h后進行固定，常規(guī)免疫熒光檢測細胞狀態(tài)。
　　 3.細胞缺氧
　　 (1)將培養(yǎng)第三天的心肌細胞進

3、行分時間段缺氧培養(yǎng)。(2)將轉(zhuǎn)染腺病毒和轉(zhuǎn)染空載體后的細胞進行分時間段缺氧培養(yǎng)。
　　 4.western blotting檢測
　　 分別將培養(yǎng)三天的心肌細胞、缺氧的心肌細胞、轉(zhuǎn)染腺病毒后的心肌細胞、轉(zhuǎn)染腺病毒后并缺氧的心肌細胞提取蛋白-20℃保存。提取CyclinA2蛋白分組進行western blotting檢測。
　　 結(jié)果
　　 1.常規(guī)免疫組化細胞染色顯示，新生大鼠心肌細胞內(nèi)cyclinA2存

4、在于細胞質(zhì)并隨著培養(yǎng)時間的增加而減少。
　　 2.新生大鼠心肌細胞差速貼壁60 mins和滴加BrdU48 h后倒置顯微鏡下觀察，可見有細胞搏動，頻率不等，大部分呈小的梭形，4d后細胞主要有三種形態(tài)：梭形、橢圓形、不規(guī)則形，搏動頻率約為(80±7)/min。
　　 3.免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示，倒置顯微鏡下觀察，新生大鼠心肌細胞缺氧6hcyclinA2表達最高，12h表達最低甚至不再表達。
　　 4.腺病毒轉(zhuǎn)染后，心

5、肌細胞中cyclinA2表達較轉(zhuǎn)染前明顯升高。
　　 5.腺病毒轉(zhuǎn)染并缺氧后cyclinA2表達變化，實驗組一：腺病毒轉(zhuǎn)染，cyclinA2表達升高。實驗組二：空載體轉(zhuǎn)染，cyclinA2無明顯變化。實驗組三：腺病毒轉(zhuǎn)染缺氧，cyclinA2表達相對升高。實驗組四：空載體轉(zhuǎn)染缺氧，cyclinA2表達在持續(xù)時間后慢慢降低。對照組：cyclinA2表達無明顯變化。
　　 結(jié)論
　　 1.cyclinA2在心肌細胞培