甘藍型油菜隱性核不育材料7365AB蛋白質(zhì)組差異分析.pdf

1、甘藍型油菜隱性核不育系，以其敗育完全、不育性穩(wěn)定、細胞質(zhì)豐富等優(yōu)點，已經(jīng)成為油菜雜種優(yōu)勢利用的重要途徑之一。在植物生長發(fā)育過程中，多酶復合體或者代謝區(qū)室扮演著重要的角色，如蛋白質(zhì)的加工和降解、呼吸鏈的電子傳遞和植物的生殖發(fā)育等。目前，關(guān)于多酶復合體在植物花藥育性方面的研究相對較少。本研究以甘藍型油菜隱性核不育材料7365AB為研究對象，運用蛋白質(zhì)組學和生物化學等方法，闡述了不育系7365A絨氈層脂類合成異常的原因及孢粉素代謝區(qū)室在油菜花

2、藥發(fā)育過程中的功能。主要研究結(jié)果如下:
　　1.7365A花藥外表皮角質(zhì)層出現(xiàn)異常
　　掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)不育材料7365A與可育材料7365B的花藥外表皮結(jié)構(gòu)存在差異，主要表現(xiàn)為不育材料7365A花藥表皮細胞變小、外表皮表面光滑、無覆蓋類似斑馬條紋的角質(zhì)層（角質(zhì)和蠟質(zhì)），推測花藥角質(zhì)層的合成發(fā)生異常。利用氣相色譜-質(zhì)譜分析法(GC-MS)和氣相色譜-火焰離子化分析法(GC-FID)分別對7365AB花藥角質(zhì)層的主要成分進行分

3、析。結(jié)果顯示，可育材料7365B的花藥角質(zhì)(cutin)總含量為2.96μg/mm2，而不育材料7365A的花藥角質(zhì)總含量為1.70μg/mm2，即7365A的花藥角質(zhì)的總含量比7365B減少42.6％;可育材料7365B花藥蠟質(zhì)(wax)總含量是0.06μg/mm2，而不育材料7365A則比7365B減少了60.0％。生化分析結(jié)果顯示，不育材料7365A的花藥脂肪酸合成發(fā)生異常。
　　2.7365AB的比較蛋白質(zhì)組學研究

4、　　為全面解析7365A花藥脂類合成受阻的原因，本研究運用蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)對不育材料7365A與可育材料7365B的小花蕾(1-2mm)的總蛋白進行差異分析。結(jié)果顯示，1000多個蛋白點中有103個蛋白點存在差異。選擇其中差異顯著的52個蛋白點進行質(zhì)譜分析，并結(jié)合生物信息學的方法進行注釋。其中有50個蛋白點成功注釋。根據(jù)注釋信息，選取花藥脂類合成途徑中的三個蛋白(BnPKSA、BnPKSB和BnTKPR1)并合成相對應(yīng)的抗體，在736

5、5AB材料中進行蛋白免疫印跡(western-blot)驗證。結(jié)果顯示，上述三個蛋白在7365B中正常表達，而在不育材料7365A中不表達，該結(jié)果與雙向電泳結(jié)果一致。
　　運用gene ontology(GO)功能聚類的方法對50個蛋白進行分析，發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要參與代謝過程，細胞生理，發(fā)育過程，逆境響應(yīng)等16個生物學過程。多數(shù)下調(diào)蛋白參與新陳代謝和細胞生化這兩個過程，推測不育材料中花藥新陳代謝出現(xiàn)紊亂;而多數(shù)上調(diào)表達蛋白參與逆境響

6、應(yīng)和蛋白質(zhì)降解這兩個過程，推測不育材料中泛素系統(tǒng)可能被激活，從而響應(yīng)逆境脅迫。
　　3.油菜絨氈層細胞中孢粉素代謝區(qū)室的作用模式
　　孢粉素是植物花粉外壁的主要成分。參與孢粉素合成的相關(guān)蛋白被證實在花粉外壁組建過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。雙向電泳分析結(jié)果顯示，三個孢粉素蛋白（BnPKSA、 BnPKSB和BnTKPR1）在7365A中顯著下調(diào)。這三個蛋白在同一時期表達，而且都參與孢粉素的生物合成。預(yù)測上述蛋白以復合體的形式發(fā)

7、揮生物學功能。本研究利用qRT-PCR、Western-blot和GUS染色多種方法證實了這三個蛋白具有相似的時空表達模式。酵母雙雜交、pull-down和熒光互補(BIFC)等互作分析表明BnPKSA和BnPKSB可以形成異源二聚體，BnPKSB可結(jié)合另一個孢粉素蛋白BnACOS5繼而形成多酶復合體;同時發(fā)現(xiàn)BnTKPR1并不與上述蛋白中的任何一個互作。孢粉素合成途徑上的三個蛋白BnPKSA、BnPKSB和BnACOS5可以形成多酶復