甘藍(lán)型油菜hau CMS蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、油菜是我國主要的油料作物，細(xì)胞質(zhì)雄性不育是油菜雜種優(yōu)勢利用的重要途徑。hau CMS是華中農(nóng)業(yè)大學(xué)傅廷棟院士1999年發(fā)現(xiàn)的天然芥菜型油菜雄性不育，是一種全新的油菜胞質(zhì)不育類型，不育徹底穩(wěn)定，不受溫度等環(huán)境因素影響，在生產(chǎn)上有廣闊的應(yīng)用前景。本研究以甘藍(lán)型油菜hau CMS不育系、保持系、育性恢復(fù)株為材料，通過Western Blot檢測不育基因的蛋白表達(dá)模式;結(jié)合iTRAQ和生物信息學(xué)技術(shù)鑒定甘藍(lán)型油菜hau CMS不育系和保持系的差

2、異表達(dá)蛋白，分析差異表達(dá)蛋白的代謝路徑與花藥敗育的關(guān)系;以不育基因orf288為誘餌構(gòu)建載體進(jìn)行酵母雙雜交，篩選甘藍(lán)型油菜花蕾cDNA文庫，尋找與不育蛋白發(fā)生互作的因子，旨在從蛋白水平分析hau CMS敗育的分子機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:
　　1.orf288不育相關(guān)基因的翻譯模式分析
　　通過設(shè)計(jì)不育相關(guān)蛋白ORF288的特異性抗體對(duì)hau CMS不育系、保持系和恢復(fù)材料的小花蕾總蛋白進(jìn)行Western雜交，從蛋白水平上驗(yàn)證

3、了orf288可能是導(dǎo)致不育的基因，且可能是從轉(zhuǎn)錄本的第二個(gè)起始密碼子處開始功能蛋白翻譯的。
　　2.酵母雙雜篩選與orf288互作基因
　　以基因orf288全長和截短orf288104-288片段構(gòu)建BD誘餌載體，對(duì)甘藍(lán)型油菜花蕾cDNA文庫分別進(jìn)行了三次篩庫，BD-288共篩選到22個(gè)互作蛋白，其中三個(gè)定位在線粒體或核糖體上，BD-185共篩選到79個(gè)互作蛋白，其中12個(gè)定位在線粒體上，10個(gè)定位在核糖體上，點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證

4、少數(shù)在四缺上可以長斑，但實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性不高，綜合所有結(jié)果，目前還沒有獲得能與BD-288或BD-185互作的蛋白。
　　3.hau CMS不育系和保持系花蕾差異表達(dá)蛋白分析
　　結(jié)合半薄切片結(jié)果確定的不育時(shí)期，通過對(duì)甘藍(lán)型hau CMS不育系和保持系小花蕾iTRAQ結(jié)果中的186個(gè)差異表達(dá)蛋白數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)不育系的兩種蛋白質(zhì)降解途徑（蛋白酶體途徑與細(xì)胞自噬途徑）中關(guān)鍵蛋白表達(dá)量均存在顯著差異。進(jìn)一步的RT-PCR