甘藍(lán)型油菜油質(zhì)蛋白（Oleosin）cDNA的克隆和表達(dá).pdf

1、油質(zhì)蛋白(Oleosin)是一類特殊的貯藏蛋白，主要在油料植物種子中特異表達(dá)，以膜嵌入方式依附在油體表面，在油體發(fā)生和分解消失過(guò)程中起著重要生物學(xué)作用。本文以甘藍(lán)型油菜種子中油質(zhì)蛋白的cDNA為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行克隆和表達(dá)，用以了解油質(zhì)蛋白在甘藍(lán)型油菜中時(shí)、空的表達(dá)以及與TAG積累的關(guān)系，同時(shí)為油質(zhì)蛋白(Oleosin)在植物基因工程中利用提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)。 1.本文利用熱CTAB-LiCl聯(lián)用法從油菜種子中提取RNA，所得到

2、的RNA樣品經(jīng)紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳分析證明具有較高的純度和完整性，并克服了油脂、多糖及次生代謝物質(zhì)等的干擾。 2.RT-PCR法從種子中擴(kuò)增Oleosin的cDNA片段和Perilipin、SREBP的cDNA片段。電泳結(jié)果表明：在植物種子中沒(méi)有擴(kuò)增到動(dòng)物脂肪周邊蛋白的cDNA片斷，而動(dòng)物中控制脂肪代謝過(guò)程中合成酶的轉(zhuǎn)錄因子有條帶，說(shuō)明動(dòng)植物在脂肪合成上有相同的脂肪合成代謝調(diào)控。測(cè)序結(jié)果表明：甘藍(lán)型和白菜型油菜種子中的

3、Oleosin的cDNA序列分別是275bp、281bp，同源性為91％。通過(guò)5’RACE對(duì)油質(zhì)蛋白的cDNA進(jìn)行全長(zhǎng)擴(kuò)增，并進(jìn)行Blast比對(duì)：484bp片段與擬南芥4號(hào)染色體A6(1989bp)的beta-1，3glucanasehomologue同源性高。 3.利用擴(kuò)增油質(zhì)蛋白的cDNA片段作探針，對(duì)不同時(shí)期和含油量不同油菜種子中的mRNA進(jìn)行Northernblotting，結(jié)果表明不同含油量的種子中，mRNA在表達(dá)上的

4、差異不明顯，說(shuō)明與含油量即TAG的積累沒(méi)有直接的關(guān)系。 4.重新設(shè)計(jì)一個(gè)單引物與5’RACE的巢式引物擴(kuò)增甘藍(lán)型與白菜型種子中油質(zhì)蛋白讀碼框的cDNA，與pMD18-T載體連接克隆、測(cè)序，甘藍(lán)型與白菜型種子中讀碼框的cDNA同源性為99％，連接上面擴(kuò)增的白菜型種子中的油質(zhì)蛋白的cDNA片段，對(duì)白菜型的Oleosin-like-protein接近全長(zhǎng)的cDNA進(jìn)行基因注冊(cè)。 5.構(gòu)建油質(zhì)蛋白讀碼框cDNA與pTYB2的表達(dá)