甘藍(lán)型油菜顯性細(xì)胞核雄性不育差異表達(dá)基因及雄配子發(fā)育研究.pdf

1、油菜是食用植物油和植物蛋白的最主要來源，也是潛在的僅次于豆粕的大宗飼用蛋白源，而且在現(xiàn)代工業(yè)上的用途也日益廣泛。隨著人們生活水平的不斷提高，對油菜產(chǎn)量和品質(zhì)的要求也相應(yīng)提高，因此，開展油菜雜種優(yōu)勢利用研究，把品質(zhì)育種與雜種優(yōu)勢利用結(jié)合起來，選育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)油菜品種已成為目前油菜育種的主攻方向。顯性細(xì)胞核雄性不育由于敗育徹底、不育性穩(wěn)定、無不良胞質(zhì)效應(yīng)等優(yōu)勢而受到重視，而且目前通過利用純合兩型系、臨保系和恢復(fù)系，已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)“三系化”繁殖、制

2、種。但是，在實(shí)際應(yīng)用中，選育純合兩型系和恢復(fù)系仍然是比較困難的工作，而且到目前為止，對這一材料的育性控制機(jī)制仍然了解的很少，因而為了更好的利用顯性核不育的材料，很有必要對其進(jìn)行深入的研究。 本研究以甘藍(lán)型油菜顯性核不育純合兩型系Rs1046AB為研究對象，運(yùn)用多種差異表達(dá)分析技術(shù)(DDRT-PCR)對姊妹系的正常植株和不育植株間差異表達(dá)的基因進(jìn)行了研究。取得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和主要結(jié)論如下： 1．DDRT-PCR，用3個錨定引物

3、和26個隨機(jī)引物，共78對引物組合對Rs1046AB的可育株和不育株進(jìn)行了差異表達(dá)分析，最終得到可以重復(fù)出現(xiàn)的差異片段26個(20個在可育材料中增強(qiáng)或特異表達(dá)，6個在不育材料中增強(qiáng)表達(dá))，但隨后的反向Northern雜交結(jié)果表明，獲得的差異片段都為假陽性片段。 2．cDNA-AFLP，共篩選了256對引物組合，每對引物組合能產(chǎn)生大約20個條帶，其中23對引物組合(8.98％)具有多態(tài)性，可以重復(fù)擴(kuò)增出的差異片段有32個(只占所有

4、擴(kuò)增片段的0.31％)，經(jīng)Blast分析，這些片段歸屬于28個unigene(其中在可育株中上調(diào)表達(dá)的有27個，不育株中只有1個)，生物信息學(xué)分析表明28個 unigene共參與了8個生物過程(不包括功能未知的)，其中只有11個片段所參與的過程是已知的，包括代謝、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期、蛋白質(zhì)命運(yùn)、細(xì)胞間運(yùn)輸、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和花發(fā)育等，這些過程與雄配子的發(fā)育都有關(guān)系，其余17個(約60.7％)片段沒有同源性或功能未知，表明可能得到了與雄配子發(fā)育相關(guān)的

5、新基因。Northern雜交的結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了cDNA-AFLP數(shù)據(jù)的可靠性。 3．利用SSH構(gòu)建了正向(可育材料作為“Tester”，即富集了可育材料中上調(diào)表達(dá)的基因)和反向(不育材料作為“Tester”，即富集了不育材料中上調(diào)表達(dá)的基因)兩個文庫，每個文庫中包含3072個克隆，經(jīng)擴(kuò)增，純化后每個文庫都得到了單帶且條帶較亮的克隆2000多個(正向文庫2080，反向文庫2293)，片段大小平均在500 bp左右。 4．將

6、上述每個文庫中經(jīng)純化后的2000多個克隆，外參(λDNA擴(kuò)增片段)，內(nèi)參(actin，β-tubulin和BNACBP)以及陰性對照(人類TFR和pUC19)在大連Takara公司點(diǎn)制成cDNAmicroarray，其中純化后的克隆在每張芯片上重復(fù)點(diǎn)兩次，每個對照重復(fù)點(diǎn)48次，芯片的雜交和分析工作按照正常的操作流程進(jìn)行，最終在正向文庫中篩選得到1369個上調(diào)表達(dá)的克隆，而反向文庫中僅有12個上調(diào)表達(dá)的克隆(比值≥2)。通過點(diǎn)雜交去除重復(fù)

7、克隆后，最終對其中400個克隆進(jìn)行了測序，Blast分析表明它們歸屬于216個unigenes(212個在可育材料中上調(diào)表達(dá)，4個在不育材料中上調(diào)表達(dá))，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)可育材料中上調(diào)表達(dá)的212個基因中，178個可以在NCBI找到同源序列。根據(jù)其參與的生物學(xué)過程，它們可以劃分為17個組(不包括未分類的蛋白)，其中參與代謝，細(xì)胞防御，細(xì)胞組分的生物合成以和蛋白命運(yùn)的占的比例最大，分別占11.11％，7.69％，6.55％和5.70％。

8、在正向文庫中，從所測序列中選取9個進(jìn)行Northern雜交驗(yàn)證，結(jié)果有8個與芯片結(jié)果一致，這說明了芯片結(jié)果的可信性；反向文庫的4個序列中有1個結(jié)果與芯片結(jié)果一致。 5．細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，Rs1046AB的不育株在減數(shù)分裂過程的初期，所有細(xì)胞都呈細(xì)胞核濃縮狀態(tài)，表明它們已經(jīng)開始降解。雖然在相當(dāng)于正常植株的四分體時期，有31％的細(xì)胞能夠脫離濃縮狀態(tài)而繼續(xù)發(fā)育，但是在染色體狀態(tài)為粗線期時，所有細(xì)胞又停止其發(fā)育，這一過程中，有部分細(xì)胞的染

9、色體出現(xiàn)隨機(jī)分裂，有些細(xì)胞則可以觀察到核質(zhì)橋和微核的出現(xiàn)。即使當(dāng)“擬小孢子”出現(xiàn)時，這些細(xì)胞核濃縮的細(xì)胞和脫離濃縮狀態(tài)的不正常細(xì)胞也能被觀察到。而這些都表明不育材料中的染色體變得很不穩(wěn)定。因此，結(jié)合差異表達(dá)的篩選結(jié)果推測，造成這種現(xiàn)象的原因可能是由于DNA錯誤信息的存在導(dǎo)致減數(shù)分裂過程中的一些檢測點(diǎn)被激活，而不育植株中由于DNA損傷修復(fù)不能正常進(jìn)行，因而不能完成減數(shù)分裂過程。本研究對通過cDNA芯片篩選到的參與DNA修復(fù)的3個ESTs進(jìn)

10、行了RT-PCR的研究，結(jié)果顯示這3個ESTs在兩材料間的表達(dá)存在明顯差異：1個在不育材料中不表達(dá)，2個在不育材料中表達(dá)量劇減，而且這三個基因都只在花蕾中表達(dá)。 6．利用KEGG Orthology(KO)-Based Annotation System(KOBAS)軟件對正向文庫中的差異表達(dá)序列進(jìn)行了分析，結(jié)果212個序列中有41個(19.34％)被分配到47個KO本體中，通過分析，共得到9個可能與雄配子發(fā)育相關(guān)的途徑，其中氮

11、素代謝，硝基苯降解和淀粉、蔗糖代謝三條途徑可能在雄配子發(fā)育過程中有著重要作用，特別是氮素代謝和硝基苯降解這兩個途徑。 7．對15個可能與雄配子發(fā)育相關(guān)的ESTs進(jìn)行了時空表達(dá)模式研究。時間表達(dá)模式研究以不同發(fā)育時期(1-5 mm)的花蕾為材料，通過Northern雜交分析表明其中有9個ESTs的表達(dá)在不育材料中被完全抑制，而其余6個ESTs雖然在兩個材料中都有所表達(dá)，但是它們的表達(dá)模式很不一致。Quantity One 軟件的定