顯性雄性核不育亞麻雄性不育相關(guān)基因的研究.pdf

1、亞麻是我國北方地區(qū)重要的油料作物和纖維作物或油纖兼用作物。亞麻籽和亞麻籽油具有保健和藥用功效。亞油酸具有降低血液中的膽固醇的作用，而α-亞麻酸是生成二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的前提物質(zhì)，EPA和DHA的適當?shù)幕旌衔锞哂薪档脱蜏p少血栓形成的作用。亞麻木酚素具有調(diào)節(jié)人體激素平衡、抑制癌癥等功效。近年來，亞麻的保健、醫(yī)藥功能不斷得到開發(fā)，對優(yōu)質(zhì)品種的需求不斷提高。但由于亞麻是自花授粉作物，其遺傳變異的擴大和雜種優(yōu)勢的

2、利用卻受到限制。因此，亞麻花藥、花粉發(fā)育過程中有關(guān)基因及其啟動子的研究對獲得基因工程亞麻雄性不育系及亞麻雜種優(yōu)勢的利用具有重要的意義。本文采用同源序列克隆法，從亞麻花蕾中克隆出與擬南芥雄性不育基因-MS2同源的亞麻MS2-F基因并對其進行了序列和表達分析以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測。構(gòu)建MS2-F基因RNAi表達載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進行亞麻的遺傳轉(zhuǎn)化。同時，開展了顯性雄性核不育亞麻可育、不育花蕾mRNA差異表達以及差異表達基因片段序列分析

3、和功能預(yù)測等研究，為揭示顯性雄性核不育亞麻不育分子機理提供了有價值的線索。研究結(jié)果如下：
　　 (1)根據(jù)擬南芥等其他植物中雄性不育相關(guān)基因氨基酸序列的保守性，應(yīng)用同源序列克隆法，首先在亞麻花蕾中擴增出258bp的一段序列，然后以該序列為基礎(chǔ)，通過RACE技術(shù)擴增了基因的5'、3'端序列，其大小分別為975bp和869bp。拼接后獲得了1911bp的cDNA序列。
　　 (2)根據(jù)該cDNA序列，設(shè)計基因特異引物，擴增基

4、因的全長cDNA和gDNA。測序結(jié)果表明，cDNA為1709bp，gDNA為2696bp，序列分析結(jié)果顯示，該基因含有8個內(nèi)含子和9個外顯。
　　 (3)該cDNA中包含一個1608 bp的ORF，編碼535個氨基酸，5'非編碼區(qū)70bp，3'非編碼區(qū)31bp。推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列中包含兩個雄性不育保守區(qū)：NAD結(jié)合區(qū)域和雄性不育C-末端區(qū)域。該基因與油菜、擬南芥雄性不育基因的一致性分別為59.65%和59.16%，為花蕾特異表達基

5、因，推測在亞麻花粉發(fā)育過程中與脂酰輔酶A還原酶有相似功能。因此，成功獲得了亞麻雄性不育相關(guān)基因，將其命名為MS2-F。其cDNA序列及其對應(yīng)的gDNA序列的基因庫登錄號分別為EU363493和EU365361。
　　 (4)構(gòu)建了兩個MS2-F基因的RNA干擾載體，一個含有該基因非雄性不育保守區(qū)序列；另一個含該基因雄性不育保守區(qū)序列。并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將構(gòu)建的MS2-F基因的RNA干擾載體導(dǎo)入亞麻中，獲得了卡那霉素抗性再生苗，

6、現(xiàn)在正在進行生根誘導(dǎo)培養(yǎng)，有望獲得抑制MS2-F表達的轉(zhuǎn)基因亞麻植株，為研究MS2-F基因的功能奠定基礎(chǔ)。
　　 (5)在顯性雄性核不育亞麻不育花蕾和可育花蕾mRNA差異顯示研究中，共獲得有或無差異片段42條。其中29條為不育差異片段，其余的13條為可育差異片段。對這42條差異片段進行反向Northern雜交驗證，最終獲得了5條不育花蕾陽性片段：G-E07-100、G-E07-330、G-E07-830、G-S273-500、A

7、-S267-300；2條可育花蕾陽性片段G-S274-250、G-S274-450。
　　 (6)這些陽性片段經(jīng)克隆、測序和BLAST序列分析，結(jié)果顯示：G-E07-100與植物GTP結(jié)合蛋白高度同源，在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中有調(diào)節(jié)作用；G-E07-330與已公布的亞麻花蕾的一段cDNA有較高的同源性；G-E07-830與β-木糖苷酶同源性很高，它可能影響了亞麻花藥、花粉中碳水化合物的代謝；G-S273-500與NAD+ADP核糖轉(zhuǎn)

8、移酶有很高的同源性；A-S267-300與分泌蛋白高度同源，推測它可能參與了核不育亞麻信號傳導(dǎo)途徑、形態(tài)發(fā)生、細胞凋亡等過程，最終影響了雄性不育的發(fā)生；G-S274-250和G-S274-450與已知植物的核苷酸堿基序列和氨基酸序列同源性很低，推測它們可能是與育性有關(guān)的新基因。
　　 (7)將G-E07-100、G-E07-330和G+E07+830陽性差異片選定為3個候選基因，并經(jīng)過Northern雜交表達分析，進一步證明，這