人前腦啡肽原基因修飾永生化大鼠神經(jīng)前體細胞株的構(gòu)建及其鎮(zhèn)痛效應研究.pdf

1、疼痛是一種常見的臨床癥狀，很多病理性疼痛本身就是一種嚴重影響患者生活質(zhì)量的疾病。對于慢性疼痛的治療，傳統(tǒng)的藥物鎮(zhèn)痛有諸多不可避免的缺陷，尤其是長期用藥所致的藥物耐受及依賴，將直接導致治療的失敗，因此尋找一種安全有效、作用持久的鎮(zhèn)痛方法已成為疼痛研究的重要方向。近年來的研究表明，轉(zhuǎn)基因細胞移植鎮(zhèn)痛是慢性疼痛治療新的研究領域，有望為疼痛治療提供一種全新的技術和方法。神經(jīng)前體細胞(neuralprogenitorcell，NPC)是一類可以分

2、裂增殖、自我更新并具有多分化潛能的細胞。它可以作為神經(jīng)細胞的種子細胞，在細胞移植治療和細胞介導的基因治療中具有潛在的臨床應用價值。但原代培養(yǎng)的NPC繁殖速度較慢，傳代周期長，且為多克隆起源，難以滿足科研和臨床研究的需要。而永生化神經(jīng)前體細胞在體外培養(yǎng)中能夠自我更新和無限擴增，可以提供大量表型、基因型穩(wěn)定的神經(jīng)前體細胞，是轉(zhuǎn)基因治療的理想細胞載體。腦啡肽是一種內(nèi)源性的阿片肽，由前腦啡肽原經(jīng)酶切加工而來，廣泛分布于外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，是中樞

3、神經(jīng)系統(tǒng)重要的鎮(zhèn)痛介質(zhì)。本研究旨在構(gòu)建人前腦啡肽原基因(humanpreproenkephalingene，hPPE)修飾的永生化大鼠神經(jīng)前體細胞株，并通過將其移植入神經(jīng)病理性痛大鼠蛛網(wǎng)膜下腔，以評價其用于鎮(zhèn)痛治療的有效性和安全性。 研究方法與結(jié)果 1、猿腎病毒40大T抗原永生化大鼠神經(jīng)前體細胞株的構(gòu)建 方法：采用貼壁法體外培養(yǎng)新生鼠室管膜下區(qū)神經(jīng)前體細胞，利用脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)染技術將含有猿腎病毒40大T抗原(

4、simianvirus40largetumorantigen，SV40Tag)基因的質(zhì)粒pCMVSV40T/PUR轉(zhuǎn)染神經(jīng)前體細胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選，陽性克隆擴大培養(yǎng)并進行連續(xù)傳代。觀察細胞的形態(tài)及其生長狀況，應用巢蛋白抗體進行細胞鑒定，5％胎牛血清誘導細胞分化后，應用免疫細胞化學法檢測其分化能力。采用RT-PCR、Southern印跡雜交和免疫細胞化學法檢測SV40Tag在轉(zhuǎn)染細胞中的表達。 結(jié)果：體外成功培養(yǎng)神經(jīng)前體細胞，細胞

5、巢蛋白表達陽性，可誘導分化為神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞；轉(zhuǎn)染SV40Tag后經(jīng)篩選培養(yǎng)后獲得1個陽性細胞克隆，免疫細胞化學結(jié)果顯示細胞的巢蛋白和微管相關蛋白2染色為陽性，增殖能力較強。5％胎牛血清可誘導轉(zhuǎn)染細胞分化為微管相關蛋白2陽性和膠質(zhì)纖維酸性蛋白陽性細胞。Southem印跡雜交結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細胞基因組中存在SV40TagcDNA，并可檢測到SV40TagmRNA及其蛋白的表達。轉(zhuǎn)染細胞經(jīng)擴大培養(yǎng)，命名為永生化神經(jīng)前體細胞(i

6、mmortalizedneuralprogenitorcell，INPC)。 2、永生化大鼠神經(jīng)前體細胞生物學特性研究 方法：選用連續(xù)傳代培養(yǎng)的INPC，觀察傳代、凍存和復蘇對細胞形態(tài)及生長的影響，透射電鏡觀察細胞的超微結(jié)構(gòu)變化，應用細胞生長曲線、5’溴-2-脫氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine，BrdU)摻入法和流式細胞儀檢測細胞增殖能力，采用裸鼠接種實驗檢測細胞的致瘤性，通過檢測細胞分化前后MHCⅠ和Ⅱ

7、類分子的表達評價其免疫原性。 結(jié)果：貼壁培養(yǎng)的INPC形態(tài)以橢圓形或三角形為主，有兩個或三個短的突起。細胞胞體較小，胞核較大，呈圓形，胞質(zhì)較少。細胞呈單層生長，存在接觸抑制現(xiàn)象。凍存與復蘇不改變INPC細胞的形態(tài)及增殖能力，目前已傳至50余代。與原代NPC相比，INPC細胞增殖指數(shù)和增殖率升高，群體倍增時間縮短。裸鼠接種實驗未見新生物長出。在常規(guī)培養(yǎng)條件下，有少量的INPC表達MHCⅠ和Ⅱ類分子，而5％胎牛血清誘導INPC分化后

8、，MHCⅠ和Ⅱ類分子的表達均為陰性。 3、人前腦啡肽原基因修飾永生化大鼠神經(jīng)前體細胞株的構(gòu)建 方法：攜帶hPPE的重組腺相關病毒2型(recombinantadeno-associatedvirustype2，rAAV2)rAAV2/hPPE和含有增強型綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，eGFP)的對照載體rAAV2/eGFP分別轉(zhuǎn)染INPC，轉(zhuǎn)染rAAV2/eGFP12h后開

9、始應用倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)rAAV2/eGFP的INPC綠色熒光蛋白的表達，并計算轉(zhuǎn)染效率，應用巢蛋白抗體和猿腎病毒40抗體進行細胞鑒定。5％胎牛血清誘導轉(zhuǎn)rAAV2/hPPEINPC分化后，應用神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞特異性標志物抗體檢測其分化能力。采用免疫細胞化學法、RT-PCR和放射免疫法檢測轉(zhuǎn)染細胞亮氨酸腦啡肽(Leu-enkephalin，L-EK)的表達及分泌。 結(jié)果：INPC轉(zhuǎn)染rAAV2/eGFP12h后即有綠色熒光

10、蛋白表達，轉(zhuǎn)染72h后，大部分細胞表達綠色熒光蛋白，轉(zhuǎn)染效率可達90％。免疫細胞化學結(jié)果顯示神經(jīng)前體細胞轉(zhuǎn)染rAAV2/hPPE后Nestin和SV40抗體染色均為陽性，且可被血清誘導分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞。免疫細胞化學法、RT-PCR和放射免疫法結(jié)果均表明轉(zhuǎn)rAAV2/hPPE永生化神經(jīng)前體細胞hPPE的表達和L-EK的分泌明顯高于未轉(zhuǎn)染細胞(P＜0.01)。 4、慢性神經(jīng)病理性痛大鼠鞘內(nèi)移植人前腦啡肽原基因修飾永生化大鼠

11、神經(jīng)前體細胞的鎮(zhèn)痛效應 方法：成年雌性SD大鼠40只，隨機分為五組：Naive組，大鼠不進行任何處理；Sham組，大鼠僅暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)分支；SNI組，大鼠右側(cè)下肢行保留性神經(jīng)損傷(sparednerveiniury，SNI)手術；INPC組和INPC/hPPE組大鼠分別于SNI術后1周鞘內(nèi)移植BrdU標記的永生化神經(jīng)前體細胞INPC或轉(zhuǎn)rAAV2/hPPE永生化神經(jīng)前體細胞(INPC/hPPE)。持續(xù)觀察大鼠行為學改變，分別于

12、SNI術前、SNI術后1周至細胞移植后8周內(nèi)每周測定各組大鼠50％機械縮爪閾值(mechanicalwithdrawalthreshold，MWT)和熱縮爪潛伏期(thermalwithdrawallatency,TWL)。于細胞移植8周后取各組大鼠L4-6脊髓組織，應用免疫組織化學法檢測移植細胞BrdU的表達和L-EK的表達，采用RT-PCR和放射免疫法檢測hPPE和L-EK的表達及分泌。 結(jié)果：SNI術后1周，大鼠痛覺行為學

13、發(fā)生改變，MWT和TWL降低(P＜0.05)；細胞移植后1周，INPC/hPPE組大鼠痛覺行為學癥狀明顯減輕，MWT和TWL升高(P＜0.05)，到細胞移植后第3周，已基本恢復至正常水平。細胞移植后8周，INPC組和INPC/hPPE組大鼠脊髓背角軟腦膜和脊髓淺層中均可檢測到移植細胞BrdU免疫染色陽性，免疫細胞化學法、RT-PCR和放射免疫法結(jié)果均表明INPC/hPPE組hPPE的表達和L-EK的分泌高于其它四組(P＜0.05)。

14、 5、統(tǒng)計學處理 采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行處理。計量資料以均數(shù)±標準差(-x±S)表示，組內(nèi)、組間比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料以率表示，組間比較采用卡方檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 研究結(jié)論 本研究成功地構(gòu)建了猿腎病毒40大T抗原永生化的大鼠神經(jīng)前體細胞株，該永生化細胞保留了原代NPC的細胞表型，為良性轉(zhuǎn)化細胞，體內(nèi)外實驗證實可作為載體細胞安全地用于轉(zhuǎn)基因細胞移植研究；本研究進一步構(gòu)建了