NT-3基因修飾雪旺細(xì)胞和NT-3受體基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞聯(lián)合移植治療大鼠全橫斷脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究旨在探討應(yīng)用NT-3基因修飾雪旺細(xì)胞和NT-3受體基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞聯(lián)合移植治療大鼠全橫斷脊髓損傷，觀察這種治療策略能否更好地促進(jìn)受損傷脊髓結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)，并分析其中可能的作用機(jī)制，為臨床治療急性脊髓損傷提供新策略及其實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究共分為以下四個(gè)部分： 第一部分人神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素．3基因重組腺病毒載體的構(gòu)建、表達(dá)和生物活性檢測(cè) 目的：構(gòu)建具有生物活性的人神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3(neurotrophin-3，NT-3)基因重組

2、腺病毒表達(dá)載體。 方法：從人腦組織mRNA中擴(kuò)增NT-3基因全長(zhǎng)cDNA，定向克隆于穿梭質(zhì)粒pShuttle中，獲得一個(gè)帶有CMV啟動(dòng)子的表達(dá)盒。再與腺病毒骨架DNA(Adeno-X viral DNA)體外連接，形成重組腺病毒質(zhì)粒(pAd-NT-3)。用pAd-NT-3轉(zhuǎn)染人胚腎293細(xì)胞后包裝成有感染能力的重組腺病毒顆粒(Ad-NT-3)。 結(jié)果：NT-3基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小約801bp。Ad-NT-3 PC

3、R鑒定為正確重組子。RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)、EUSA及Wlestem blot檢測(cè)顯示Ad-NT-3能夠在其轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞表達(dá)和分泌NT-3。這種NT-3能使體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞更多地分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。 結(jié)論：應(yīng)用體外連接法成功構(gòu)建了人NT-3基因重組腺病毒表達(dá)載體，其表達(dá)產(chǎn)物具有促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞活性作用。 第二部分NT-3受體TrkC基因重組腺病毒載體的構(gòu)建、表達(dá)及生物學(xué)活性檢測(cè) 目的：

4、構(gòu)建人NT-3受體TrkC基因重組的腺病毒表達(dá)載體(Ad-TrkC)，并探討Ad-TrkC介導(dǎo)的TrkC基因在神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及其對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的生物活性作用。 方法：從人腦組織mRNA中擴(kuò)增TrkC基因全長(zhǎng)cDNA，定向克隆于穿梭質(zhì)粒pShuttle中，獲得一個(gè)帶有CMV啟動(dòng)子的表達(dá)盒。再將表達(dá)盒與腺病毒骨架DNA(Ad-X viral DNA)體外連接，形成重組腺病毒質(zhì)粒(pAd-TrkC)。用pAd-TrkC轉(zhuǎn)染人胚腎29

5、3細(xì)胞后包裝成有感染能力的重組腺病毒顆粒(Ad-TrkC)。用RT-PCR檢測(cè)Ad-TrkC感染的神經(jīng)干細(xì)胞的TrkC mRNA含量。用免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blot檢測(cè)Ad-TrkC感染的神經(jīng)干細(xì)胞TrkC受體蛋白水平。在體外培養(yǎng)條件下，觀察人NT-3對(duì)感染了Ad-TrkC的神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞和星形膠質(zhì)樣細(xì)胞的影響。 結(jié)果：TrkC基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為2478bp。Ad-TrkC經(jīng)PCR鑒定為正確重組子

6、。在Ad-TrkC感染的神經(jīng)干細(xì)胞中檢測(cè)到TrkC mRNA和TrkC受體蛋白，且表達(dá)產(chǎn)物和其配體NT-3結(jié)合后能使體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞更多地分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，分化率達(dá)到55.2％，均高于其它對(duì)照組。 結(jié)論：應(yīng)用體外連接法構(gòu)建了人TrkC重組腺病毒表達(dá)載體，Ad-TrkC能在神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)表達(dá)TrkC受體蛋白，這種TrkC受體蛋白具有促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞活性的作用，這為進(jìn)一步應(yīng)用NT-3和TrkC聯(lián)合進(jìn)行基因治療中樞

7、神經(jīng)損傷研究奠定了基礎(chǔ)。 第三部分NT-3基因修飾雪旺細(xì)胞和nkC基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞體外聯(lián)合培養(yǎng)促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化為具有形成突觸潛能的神經(jīng)元樣細(xì)胞 目的：探討NT-3基因修飾雪旺細(xì)胞(SCs)和TrkC基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)體外聯(lián)合培養(yǎng)對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化為具有形成突觸潛能的神經(jīng)元樣細(xì)胞的影響。 方法：應(yīng)用各種MOI的Ad-GFP感染SCs和NSCs 24h后流式細(xì)胞儀(FCM) 檢測(cè)SCs和NSCs

8、的感染率，確定最適感染劑量。ELISA法定量檢測(cè)Ad-NT-3感染SCs 24h后上清中NT-3的含量。X-gal酶組織化學(xué)染色檢測(cè)Ad-LacZ感染的NSCs的β-半乳糖苷酶的表達(dá)。將含NT-3基因的重組腺病毒(Ad-NT-3)感染SCs(NT-3-SCs)，同時(shí)將含TrkC基因的重組腺病毒(Ad-TrkC)感染NSCs(TrkC-NSCs)，然后兩者聯(lián)合在體外共培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)共分6組：NT-3-SCs+TrkC-NSCs組、NT-3-S

9、Cs+NSCs組、SCs+NSCs組、NSCs組、LacZ-SCs+LacZ-NSCs組和TrkC-NSCs組。培養(yǎng)4d后做nestin、MAP2、GFAP免疫組化，觀察NSCs的分化并計(jì)算其中神經(jīng)元樣細(xì)胞(MAP2陽性)和星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞(GFAP陽性)的分化率以及保持未分化狀態(tài)(nestin陽性)的比率，并用PSD95和svnapsin免疫組化方法觀察并計(jì)算其中具有形成突觸潛能的神經(jīng)元樣細(xì)胞的比率。 結(jié)果：1.SCs的最適

10、感染劑量為10 MOI，NSCs為80 MOI。2.ELISA法顯示NT-3-SCs培養(yǎng)液中NT-3的含量明顯高于未基因修飾的SCs。3.Ad-LacZ感染的NSCs呈β-半乳糖苷酶陽性。4.NSCs在體外可分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)樣細(xì)胞，與其它實(shí)驗(yàn)組相比，NT-3-SCs+TrkC-NSCs組能更有效地提高神經(jīng)元樣細(xì)胞的分化率，其中具有形成突觸潛能的神經(jīng)元樣細(xì)胞的比率最高。而LacZ-SCs+LacZ-NSCs組與SCs+NSCs

11、組、NT-3-SCs+NSCs組與TrkC-NSCs組之間沒有明顯差別。 結(jié)論：NT-3基因修飾雪旺細(xì)胞和TrkC基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞體外聯(lián)合培養(yǎng)能夠促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向具有形成突觸潛能的神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。 第四部分NT-3基因修飾雪旺細(xì)胞和TrkC基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞聯(lián)合移植促進(jìn)全橫斷脊髓損傷修復(fù)的研究 目的：探討NT-3基因修飾SCs和TrkC基因修飾NSCs聯(lián)合移植能否促進(jìn)全橫斷脊髓損傷修復(fù)的研究。 方法：

12、用NT-3基因的重組腺病毒(Ad-NT-3)感染培養(yǎng)的SCs(NT-3-SCs)．同時(shí)用含TrkC基因的重組腺病毒(Ad-TrkC)感染培養(yǎng)的NSCs(TrkC-NSCs)。此外，還將Ad-LacZ分別感染SCs和NSCs。然后建立大鼠全橫斷脊髓損傷模型，將NSCs、LacZ-SCs+LacZ-NSCs、NT-3-SCs+NSCs和NT-3-SCs+TrkC-NSCs分別移植到損傷處。所有動(dòng)物存活60d后，進(jìn)行爬網(wǎng)格測(cè)驗(yàn)和BBB評(píng)分。接

13、著在脊髓橫斷處遠(yuǎn)端3mm組織內(nèi)注射熒光金(FG)，動(dòng)物再存活7d。在處死動(dòng)物前檢測(cè)皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位(CMEP)和皮質(zhì)體感誘發(fā)電位(CSEP)。最后灌注固定動(dòng)物，取材和切片并行形態(tài)學(xué)觀察。 結(jié)果：1.行為學(xué)檢測(cè)顯示，各細(xì)胞移植組與對(duì)照組相比，能促進(jìn)大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，其中恢復(fù)最好的是NT-3-SCs+TrkC-NSCs組。2.電生理檢測(cè)顯不NT-3-SCs+TrkC-NSCs組CSEP、CMEP的峰值明顯增大。3.NSCs能在

14、損傷脊髓內(nèi)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)樣細(xì)胞。NT-3-SCs和TrkC-NSCs聯(lián)合移植能提高NSCs在損傷脊髓內(nèi)向神經(jīng)元樣細(xì)胞的分化率，NT-3-SCs+TrkC-NSCs組的MAP2陽性細(xì)胞的比率為24.63％，高于其它處理組。4.各細(xì)胞移植組在脊髓橫斷處及附近有GAP-43、PSD95和synapsin陽性神經(jīng)元樣細(xì)胞，以及5-HT、D β H和ChAT陽性神經(jīng)纖維。5.在移植組中，脊髓橫斷處頭側(cè)端、中腦紅核及大腦體感運(yùn)動(dòng)區(qū)皮質(zhì)

15、內(nèi)錐體細(xì)胞層有少量FG標(biāo)記神經(jīng)元。6.與其它組相比，NT-3-SCs+TrkC-NSCs組L<,1>脊髓背核、中腦紅核及大腦體感運(yùn)動(dòng)區(qū)皮質(zhì)內(nèi)錐體細(xì)胞層存活的神經(jīng)元數(shù)增多。7.基因修飾細(xì)胞移植到受損傷脊髓2個(gè)月后仍能表達(dá)外源基因產(chǎn)物(NT-3、TrkC和LacZ)。8.NT-3.SCs和TrkC-NSCs聯(lián)合移植能提高LN的表達(dá)，降低CSPGs的表達(dá)。9.電鏡下可見細(xì)胞移植組的脊髓損傷區(qū)內(nèi)有再生的有髓鞘神經(jīng)纖維和突觸樣結(jié)構(gòu)。 結(jié)論