應(yīng)用NT-3基因修飾的雪旺細(xì)胞與RA體外預(yù)誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化并聯(lián)合移植治療全橫斷脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究旨在探討應(yīng)用人NT-3基因轉(zhuǎn)染的雪旺細(xì)胞(SchwannCells，SCs)與維甲酸(retinoicacid，RA)體外預(yù)誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcell，NSCs)分化并聯(lián)合移植對(duì)大鼠全橫斷脊髓損傷的治療作用，從而為急性脊髓損傷的治療探索一種新策略，本研究共分為四個(gè)部分。 第一部分神經(jīng)干細(xì)胞和雪旺細(xì)胞的體外培養(yǎng)、純化及鑒定 目的 改良出一種快速、簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)而又能得到足夠純度、足夠量的NSCs

2、和SCs的細(xì)胞培養(yǎng)方法，為研究應(yīng)用NSCs和SCs提供穩(wěn)定、可靠的細(xì)胞來(lái)源。方法選用SD乳鼠，取海馬組織，用胰酶消化法和機(jī)械吹打法培養(yǎng)NSCs；取坐骨神經(jīng)和臂叢神經(jīng)，用單細(xì)胞雙酶消化法和半植塊單酶消化法培養(yǎng)SCs。結(jié)果用同樣多的材料，機(jī)械吹打法所獲得的NSCs是胰酶消化法所獲細(xì)胞的四倍，省時(shí)至少20min，免疫組化結(jié)果顯示獲得的神經(jīng)干細(xì)胞呈nestin陽(yáng)性；用同樣多的材料，半植塊單酶消化法所獲得的SCs比單細(xì)胞雙酶消化法所獲細(xì)胞至少多兩

3、倍，省時(shí)至少40min，免疫組化結(jié)果顯示獲得的雪旺細(xì)胞96％以上呈S-100陽(yáng)性。結(jié)論用改良的機(jī)械吹打法培養(yǎng)NSCs；用單酶消化半植塊法培養(yǎng)SCs，能在短時(shí)間內(nèi)獲得足夠量、足夠純度、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的NSCs和SCs。 第二部分雪旺細(xì)胞和維甲酸體外協(xié)同性促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向具有形成突觸潛能的神經(jīng)元方向分化 目的 研究體外聯(lián)合應(yīng)用SCs和RA對(duì)NSCs向具有形成突觸潛能的神經(jīng)元方向分化的作用。方法采用2×2析因設(shè)計(jì)方法，N

4、SCs分別用RA，SCs和SCs+RA處理6d，所用培養(yǎng)液為含0.5％小牛血清的DMEM/F12。用免疫熒光雙標(biāo)來(lái)檢測(cè)NSCs的分化情況，包括nestin，GFAP和Map2；PSD95的表達(dá)表明突觸的發(fā)生。結(jié)果與對(duì)照組相比，用RA或SCs處理后，nestin和GFAP的表達(dá)顯著下降，Map2的表達(dá)顯著增加，用SCs處理后，PSD95的表達(dá)顯著增加；析因設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果表明，SCs和RA在誘導(dǎo)Map2和PSD95的表達(dá)方面有顯著性交互

5、作用，且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論SCs和RA體外能協(xié)同性促進(jìn)NSCs向具有形成突觸潛能的神經(jīng)元方向分化，但在減少nestin陽(yáng)性NSCs，減少NSCs向膠質(zhì)細(xì)胞分化方面只是一種附加作用。 第三部分體外聯(lián)合應(yīng)用人NT-3基因轉(zhuǎn)染的雪旺細(xì)胞與維甲酸促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向具有形成突觸潛能的神經(jīng)元方向分化目的 研究體外聯(lián)合應(yīng)用人NT-3基因轉(zhuǎn)染的SCs和RA對(duì)NSCs向具有形成突觸潛能的神經(jīng)元方向分化的作用。方法RT-PCR方法檢測(cè)RA誘

6、導(dǎo)前后NSCs中trkCmRNA的表達(dá)情況；擴(kuò)增、純化重組腺病毒，并檢測(cè)病毒滴度，用腺病毒載體介導(dǎo)的人NT-3基因(AdvNT-3)轉(zhuǎn)染SCs，用免疫組織化學(xué)法和ELISA法檢測(cè)NT-3的表達(dá)和分泌。NSCs分別用SCs，SCs+RA，AdvLacZ-SCs，AdvNT-3-SCs，AdvNT-3-SCs+RA和AdvLacZ-SCs+RA處理6d。用nestin、GFAP、Map2和PSD95免疫熒光雙標(biāo)法來(lái)檢測(cè)NSCs的分化情況。結(jié)

7、果1.NSCs在RA誘導(dǎo)前后都有TrkC受體mRNA的表達(dá)；2.通過(guò)擴(kuò)增、純化獲得了較高滴度的兩種重組腺病毒，至少達(dá)到1010pfu/ml；3.重組腺病毒載體能有效的轉(zhuǎn)染46.82％的雪旺細(xì)胞；4.在人AdvNT-3轉(zhuǎn)染第4、7、14d時(shí)每105細(xì)胞24h內(nèi)分別可以產(chǎn)生約35.21±7.40ng、24.05±3.47ng、14.16±1.11ng的人NT-3因子。5.與SCs，AdvLacZ-SCs，SCs+RA組相比，用AdvNT-3

8、-SCs處理后，能顯著性減少GFAP的表達(dá)，能顯著性增加Map2和PSD95的表達(dá)；與其他組相比，用AdvNT-3-SCs+RA處理后，nestin和GFAP的表達(dá)顯著下降，Map2和PSD95的表達(dá)顯著增加，且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論聯(lián)合應(yīng)用人NT-3基因轉(zhuǎn)染的SCs和RA能進(jìn)一步促進(jìn)NSCs向具有形成突觸潛能的神經(jīng)元方向分化，同時(shí)減少nestin陽(yáng)性NSCs，減少NSCs向膠質(zhì)細(xì)胞的分化。 第四部分應(yīng)用人NT-3基因轉(zhuǎn)染的雪旺細(xì)

9、胞與維甲酸體外預(yù)誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化并聯(lián)合移植治療大鼠全橫斷脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究目的 探討應(yīng)用人NT-3基因轉(zhuǎn)染的雪旺細(xì)胞與維甲酸體外預(yù)誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化并聯(lián)合移植對(duì)大鼠全橫斷脊髓損傷的治療作用。方法取成年雌性SD大鼠37只，隨機(jī)分為5組，分別為：1.體外分化組，用人NT-3基因修飾雪旺細(xì)胞與維甲酸體外預(yù)誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化6d后再聯(lián)合移植；2.體外分化對(duì)照組，用LacZ基因修飾的雪旺細(xì)胞與維甲酸體外預(yù)誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化6天后再聯(lián)合移

10、植；3.體內(nèi)分化組，將人NT-3基因修飾雪旺細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞聯(lián)合移植后使神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)分化；4.實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，脊髓全橫斷后僅填充吸附培養(yǎng)液的明膠海綿；5.正常對(duì)照組，不做手術(shù)。采用脊髓胸10段全橫斷損傷模型，于全橫斷后在脊髓損傷處以明膠海綿為支架立即進(jìn)行細(xì)胞移植，各組神經(jīng)干細(xì)胞在移植前分別用Hoechst33342進(jìn)行標(biāo)記。術(shù)后53d時(shí)，在皮質(zhì)體感區(qū)進(jìn)行BDA順行標(biāo)記；術(shù)后60d時(shí)，分別進(jìn)行BBB評(píng)分和爬網(wǎng)格測(cè)驗(yàn)，觀察各組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功

11、能的恢復(fù)情況；術(shù)后61d時(shí)，在脊髓橫斷下方胸12節(jié)段進(jìn)行FG逆行標(biāo)記；術(shù)后68d時(shí)進(jìn)行灌注固定、取材及形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果1.中性紅染色后計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組相比，各細(xì)胞移植組大腦皮質(zhì)體感運(yùn)動(dòng)區(qū)內(nèi)錐體細(xì)胞層、中腦紅核、及脊髓L1背核存活神經(jīng)元數(shù)目均顯著增多，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.NT-3免疫熒光化學(xué)染色結(jié)果顯示，基因修飾SCs移植到損傷脊髓2個(gè)月后仍能表達(dá)外源基因。3.三個(gè)細(xì)胞移植組的脊髓橫斷處損傷區(qū)均檢測(cè)到由移植神經(jīng)干細(xì)胞分化來(lái)的Map2

12、、NF、GFAP、PSD95、synapsin、ChAT染色陽(yáng)性的細(xì)胞，并能檢測(cè)到nestin雙標(biāo)陽(yáng)性的細(xì)胞，其中Map2陽(yáng)性細(xì)胞百分率，體外分化組最高，體內(nèi)分化組最低，體外分化對(duì)照組介于兩者之間，三組之間兩兩相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組相比，三個(gè)細(xì)胞移植組的脊髓橫斷處及附近，均可看到多少不等的Map2、NF-200、GAP-43、5-HT陽(yáng)性神經(jīng)纖維，脊髓橫斷處檢測(cè)到少量BDA陽(yáng)性神經(jīng)纖維，但其尾側(cè)卻沒(méi)有，在中腦紅核和脊髓橫斷

13、處頭側(cè)端有少量神經(jīng)元被FG標(biāo)記。5.在三個(gè)細(xì)胞移植組的脊髓橫斷處MBP的表達(dá)缺如范圍明顯減少，CSPG的表達(dá)明顯減少。6.行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明三個(gè)細(xì)胞移植組對(duì)脊髓損傷后大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)都有比較顯著的促進(jìn)作用，與體外分化對(duì)照組相比，體外分化組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)更好一些，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。7.電鏡下，在細(xì)胞移植組中脊髓損傷處有少量再生的神經(jīng)纖維軸突由厚薄不均的新生髓鞘包繞。結(jié)論應(yīng)用人NT-3基因轉(zhuǎn)染的雪旺細(xì)胞與維甲酸體外預(yù)誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞