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文檔簡介
1、鐵調(diào)素(hepcidin)由肝細(xì)胞分泌的25個(gè)氨基酸抗菌肽組成,是維持機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)的一種關(guān)鍵性―核心負(fù)性調(diào)節(jié)因子‖,在鐵轉(zhuǎn)移通路中發(fā)揮著主要作用。當(dāng)機(jī)體hepcidin受抑制時(shí),腸道鐵吸收及巨噬細(xì)胞鐵釋放增加,使更多的鐵離子可被吸收并利用來造血。本課題組已通過實(shí)驗(yàn)證明,給藥當(dāng)歸多糖(ASP)兩周以后,正常大鼠肝臟中hepcidin的表達(dá)水平明顯下降。本次實(shí)驗(yàn)主要目的是研究當(dāng)歸多糖抑制正常大鼠hepcidin的表達(dá)是否具有量效依賴關(guān)系,以及
2、當(dāng)歸多糖抑制正常大鼠hepcidin表達(dá)的分子機(jī)制。
臨床檢測(cè)發(fā)現(xiàn)慢性炎癥貧血患者體內(nèi)hepcidin含量顯著升高,為進(jìn)一步研究當(dāng)歸多糖能否通過下調(diào)hepcidin的含量對(duì)慢性炎癥貧血發(fā)揮治療作用,我們采用足跖注射弗氏完全佐劑建立慢性炎癥貧血(ACD)大鼠模型。檢測(cè)灌胃不同濃度當(dāng)歸多糖后ACD大鼠體內(nèi)hepcidin、血常規(guī)、血清鐵及炎性因子等指標(biāo)的變化,研究當(dāng)歸多糖調(diào)節(jié)ACD大鼠hepcidin表達(dá)的分子機(jī)制。
第
3、一部分不同濃度當(dāng)歸多糖對(duì)正常大鼠體內(nèi)hepcidin表達(dá)的抑制作用及分子機(jī)制研究
采用傳統(tǒng)的水煮法從當(dāng)歸飲片中提取當(dāng)歸多糖,合并得到的兩次水提液。水提液中加入一定量的Ca(OH)2生成絮狀沉淀,除去蛋白質(zhì)、鞣酸等雜質(zhì)。濾液加濃硫酸調(diào)節(jié)PH至5—6,既能除雜又調(diào)整了溶液PH,在60℃烘箱中烘干成浸膏狀。采用5%苯酚—硫酸法測(cè)定當(dāng)歸浸膏的糖含量,用無水葡萄糖配制對(duì)照品溶液,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得浸膏糖含量均在70%以上,滿足灌胃給藥的
4、要求。
將48只健康SD雄性大鼠,隨機(jī)分成6組,每組8只。陰性對(duì)照組每天灌胃生理鹽水1mL,連續(xù)給藥20天;陽性對(duì)照組分為低劑量組(腹腔注射rhEPO800U/kg)和高劑量組(腹腔注射rhEPO2000U/kg),每日注射一次連續(xù)給藥3天。實(shí)驗(yàn)組大鼠分低、中、高三個(gè)劑量,分別灌胃0.3g/kg、0.6g/kg和1.2g/kg當(dāng)歸多糖20天。給藥前及給藥完成后分別對(duì)各大鼠進(jìn)行一次眼眶取血,用于測(cè)定血液相關(guān)指標(biāo)的含量變化。將大鼠
5、處死后取肝臟,烘干至恒重測(cè)定肝臟鐵含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)灌胃0.3g/kg、0.6g/kg和1.2g/kg當(dāng)歸多糖組大鼠與給藥前相比,血清hepcidin含量分別下降了19.4%,27.1%和31.2%。隨著當(dāng)歸多糖給藥劑量的增加,對(duì)hepcidin的抑制作用增強(qiáng)。腹腔注射rhEPO800U/kg和rhEPO2000U/kg的正常大鼠,血清hepcidin分別下降了24.3%和29.5%。與陰性對(duì)照組相比,rhEPO兩個(gè)劑量組的紅細(xì)胞、血紅蛋白
6、含量均顯著升高,而低、中、高三個(gè)當(dāng)歸多糖劑量組的紅細(xì)胞、血紅蛋白含量無明顯變化。陰性對(duì)照組血清鐵含量為2.71±0.53mg/L,800U/kgrhEPO和2000U/kgrhEPO組大鼠血清鐵含量分別為2.08±0.39mg/L、1.70±0.18mg/L,與陰性對(duì)照組比較,EPO顯著降低血清鐵含量。實(shí)驗(yàn)組中只有高劑量(1.2g/kg)當(dāng)歸多糖組血清鐵含量顯著降低,為1.68±0.27mg/L。陽性對(duì)照組的肝臟鐵含量也顯著降低,同時(shí)1
7、.2g/kg當(dāng)歸多糖大鼠肝臟鐵含量出現(xiàn)明顯的下降,這是因?yàn)殍F在機(jī)體中重新分配以滿足紅細(xì)胞生成的需要。
從正常大鼠肝臟提取組織蛋白液,蛋白免疫印跡法(westernblot)檢測(cè)信號(hào)因子含量。結(jié)果顯示,ASP通過下調(diào)肝細(xì)胞JAK2總蛋白含量,使得p-JAK2相應(yīng)減少。與JAK2總蛋白含量相比,2000U/kgrhEPO給藥組大鼠的p-JAK2含量顯著降低,說明EPO主要抑制JAK2蛋白磷酸化過程而不是抑制總蛋白JAK2的表達(dá)。A
8、SP和rhEPO均能顯著下調(diào)p-SMAD1/5/8含量,使得進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與hepcidin基因啟動(dòng)子相結(jié)合的磷酸化二聚物合成受阻,抑制hepcidin的表達(dá)。與陰性對(duì)照組相比,ASP和rhEPO給藥組的信號(hào)蛋白Erk1/2和TMPRSS6含量無明顯變化,說明ASP和rhEPO不能通過Erk1/2和TMPRSS6途徑抑制hepcidin表達(dá)。
第二部分不同濃度當(dāng)歸多糖對(duì)ACD大鼠體內(nèi)hepcidin表達(dá)的抑制作用及分子機(jī)制研究<
9、br> SD雄性大鼠足跖注射100ul含10mg/ml結(jié)核分枝桿菌的弗氏完全佐劑(CFA),建立慢性炎癥貧血(ACD)模型。注射側(cè)后足在給藥后出現(xiàn)原發(fā)性腫脹,非注射對(duì)側(cè)足和前足在注射后第十天繼發(fā)腫脹發(fā)生明顯,耳朵、尾巴紅腫甚至出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎“結(jié)節(jié)”等繼發(fā)病變。與對(duì)照組相比,模型組大鼠紅細(xì)胞、血紅蛋白和血清鐵含量降低,分別為6.06×1012/L,92.4g/L和1.78mg/L,而炎癥相關(guān)指標(biāo)如白細(xì)胞計(jì)數(shù)、IL-6和TNF-α含量顯著升高
10、,分別為2.58×1010/L,84.10pg/ml和68.34pg/ml,弗氏完全佐劑建立的模型符合ACD的發(fā)病特征。
治療ACD的關(guān)鍵是抗炎以及改善貧血,實(shí)驗(yàn)組的ACD大鼠每天分別灌胃0.5g/kg和1.0g/kg的當(dāng)歸多糖,連續(xù)給藥4周。陽性對(duì)照組是每天給ACD大鼠灌胃10mg/kg雙氯芬酸鈉,連續(xù)給藥4周。測(cè)量足腫脹,以及檢測(cè)血常規(guī)、hepcidin、血清鐵和炎性因子等指標(biāo)。高劑量當(dāng)歸多糖組(1.0g/kg)比低劑量當(dāng)
11、歸多糖組(0.5g/kg)抑制ACD大鼠hepcidin表達(dá)的作用強(qiáng),抑制率分別為43.1%和28.7%。與模型組大鼠相比,雙氯芬酸鈉組的血清hepcidin含量也顯著降低了38.0%。雙氯芬酸鈉抑制ACD大鼠原發(fā)性足腫脹和繼發(fā)性足腫脹的作用均強(qiáng)于1.0g/kg當(dāng)歸多糖高劑量組。模型組大鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)2.58×1010/L,給藥雙氯芬酸鈉和1.0g/kg當(dāng)歸多糖治療后白細(xì)胞含量顯著下降,分別為1.59×1010/L和1.77×1010/L
12、。雙氯芬酸鈉和當(dāng)歸多糖均能顯著下調(diào)ACD大鼠血清炎性因子IL-6和TNF-α的含量,并且雙氯芬酸鈉的抑制作用更顯著。觀察足部X光和滑膜蘇木素-伊紅(H-E)染色切片發(fā)現(xiàn)雙氯芬酸鈉對(duì)大鼠關(guān)節(jié)保護(hù)、下調(diào)炎癥細(xì)胞含量的作用最顯著。這說明雙氯芬酸鈉對(duì)ACD大鼠的抗炎作用強(qiáng)于1.0g/kg當(dāng)歸多糖。模型組大鼠紅細(xì)胞計(jì)數(shù)6.06×1012/L,給藥雙氯芬酸鈉和1.0g/kg當(dāng)歸多糖治療后紅細(xì)胞含量顯著升高,分別為7.68×1012/L和8.16×1
13、012/L。1.0g/kg當(dāng)歸多糖治療的ACD大鼠不僅紅細(xì)胞含量明顯增加,與模型組比較,其血紅蛋白和血清鐵等鐵代謝相關(guān)指標(biāo)含量也顯著升高,這表明當(dāng)歸多糖(1.0g/kg)對(duì)ACD大鼠的―補(bǔ)血補(bǔ)鐵‖效果十分顯著。高劑量當(dāng)歸多糖對(duì)ACD大鼠的治療作用強(qiáng)于當(dāng)歸多糖低劑量組。
Westernblot結(jié)果顯示,當(dāng)歸多糖和雙氯芬酸鈉均能通過下調(diào)ACD大鼠肝臟信號(hào)蛋白JAK2、STAT3和p-SMAD1/5/8含量抑制hepcidin的表達(dá)
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